肿瘤坏死因子α诱导蛋白3和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂表达与鼻咽癌组织放疗敏感的相关性

邓香群，贺印旎，叶 旭

湖南邵阳医学高等专科学校 1组织学与胚胎学教研室 2预防医学教研室，湖南邵阳4220003湖南省肿瘤医院核医学科，长沙410013

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂表达与鼻咽癌组织放疗敏感的相关性

邓香群1，贺印旎2，叶 旭3

湖南邵阳医学高等专科学校1组织学与胚胎学教研室2预防医学教研室，湖南邵阳4220003湖南省肿瘤医院核医学科，长沙410013

目的 检测肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(Maspin)在放疗敏感及放疗抗拒鼻咽癌中的表达差异，探讨该表达差异与放疗抗拒发生发展的关系。方法 采用TNFAIP3和Maspin多点标记的DIG探针原位杂交方法检测TNFAIP3 mRNA和Maspin mRNA在放疗敏感及放疗抗拒鼻咽癌中的表达。结果 放疗敏感和放疗抗拒鼻咽癌中，TNFAIP3 mRNA中度和强阳性表达率分别为27．50%和48．33%(P=0．037)，Maspin mRNA中度和强阳性表达率分别为67．50%和46．67%(P=0．040)。放疗抗拒鼻咽癌中，TNFAIP3 mRNA中度和强阳性表达率与TNM分期呈正相关(P=0．005)，有远处转移者表达率显著高于无远处转移者(70．00%比37．50%，P=0．018);Maspin mRNA中度和强阳性表达率与TNM分期呈正相关(P=0．039)，与T分期亦呈正相关(P=0．021)，有远处转移者表达率显著高于无远处转移者(65．00%比37．50%，P=0．044)。结论 TNFAIP3可能参与放疗抗拒鼻咽癌的发生和发展，Maspin可能参与放疗抗拒鼻咽癌的侵袭与转移。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3基因;乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因;放射治疗;鼻咽癌

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):279-284

鼻咽癌是一种多基因遗传性肿瘤，在我国是高发恶性肿瘤，放射治疗是其最有效的治疗方法，因此研究放疗抗拒的鼻咽癌具有重要意义。放射治疗主要是损伤DNA，使细胞发生分子水平变化。肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3)，又称泛素编辑蛋白A20，调控泛素依赖的核因子(nuclear factor，NF)-κB以及细胞生存信号通路，其单核苷酸多态性与炎症、自身免疫密切相关［1］。TNFAIP3具有抗肿瘤效应，在乳腺癌、肾透明细胞癌、结直肠癌中发现其异常高表达［2］，但目前其在鼻咽癌中的研究甚少。乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(mammary serine protease inhibitor，Maspin)基因于1994年首次从乳腺上皮组织中提取出来，实时PCR检测显示，Maspin mRNA在原发肿瘤中的表达较正常组织降低［3］;免疫组织化学检测显示，Maspin在放疗抗拒鼻咽癌组织中较放疗敏感组织中表达下调［4］。Maspin蛋白在癌细胞核内外均有表达，细胞核内表达提示预后较好，而胞质内出现Maspin蛋白提示预后不良［5-6］。在老年喉癌患者中，Maspin的表达和定位与喉癌复发率和无瘤生存期显著相关［7］。Maspin可抑制血管生成，抑制组蛋白去乙酰化酶1，增加DNA修复蛋白Ku70乙酰化，Ku70与细胞凋亡相关基因Bax分离，促进癌细胞凋亡［8-9］。研究显示，Maspin的表达调控主要在转录水平，Maspin在肿瘤进展中失表达，可能是因为其启动子区域的转录因子Ets和APDNA1结合位点的转录活性缺失［10］。本研究拟通过检测和比较TNFAIP3和Maspin在放疗敏感及放疗抗拒鼻咽癌患者中的表达情况，探讨其与放疗抗拒鼻咽癌的相关性。

对象和方法

对象 2006年1月至2007年12月湖南省肿瘤医院首次入院的鼻咽癌患者100例，经病理诊断，除5例为中分化鳞状细胞癌外，其余均为低分化鳞状细胞癌。所有病例均有完整的临床病理资料及3年或3年以上随访记录，其中放疗抗拒60例，放疗敏感40例。放疗抗拒标准:根治性放疗后3个月复查原发灶和(或)淋巴结残留;根治性放疗后1年内出现鼻咽新生物和(或)新生淋巴结;放疗后13～24个月出现复发。诊断依据:(1)临床症状及体征;(2)鼻咽和颈部MRI或CT(平扫+增强);(3)病理诊断为复发。放疗敏感标准:根治性放疗后3个月复查原发灶和(或)淋巴结无残留;根治性放疗后1年内未出现鼻咽新生物和(或)新生淋巴结;放疗后13～24个月未出现复发或转移;随访3年或3年以上无复发转移者。诊断依据:(1)临床症状及体征;(2)鼻咽和颈部MRI或CT(平扫+增强)。

主要试剂 探针及试剂盒均购自天津灏洋生物公司。探针合成序列:TNFAIP3:5’-ATTGCCGTCACCGTTCGTTTTCAGCG-3’，5’-AGTTGCGTGTGTCTGTTTCCTTGAGCG-3’，5’-TGTCCCATTCATCATTCCAGTTCCGAG-3’;Maspin:5’-CAGATTGGAGAGAAGAGGACATTGCCC-3’，5’-AGGATTTTGGTCTGGTCGTTCACACTG-3’，5’-TTTTGGAATGGAGAGTTTGACCTTGGCA-3’。试剂:寡核苷酸探针预杂交液，寡核苷酸探针杂交TNFAIP3和Maspin，寡核苷酸阴性探针杂交液 TNFAIP3和Maspin，复合消化液(P/E，pH值为6．4)，生物素标记的小鼠抗地高辛，高敏过氧化物酶链亲和素复合物，2xssc干粉。

TNFAIP3及Maspin多点标记的地高辛探针原位杂交检测 将采集的石蜡块制作成石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水，置入打孔液中室温下放置10 min，置入过氧化氢封闭液室温下放置20 min，封闭内源性过氧化氢酶。滴加复合消化液，覆盖组织表面，室温下消化10～30 min。滴加预杂交工作液覆盖组织，37℃湿盒孵育2 h，预杂交后洗涤。滴加杂交工作液覆盖组织，37℃湿盒孵育8 h，对照组滴加阴性探针杂交液，杂交后洗涤。滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，覆盖组织37℃湿盒孵育45 min，滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液，覆盖组织37℃湿盒孵育45 min。DAB显色，显微镜下观察。苏木素复染，胞核为蓝色。脱水，封片。

结果判定 细胞质显棕黄色为TNFAIP3 mRNA和Maspin mRNA阳性反应。观察阳性细胞所占比例和着色深度。阳性细胞比例:＜25%为1分，25%～50% 为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。着色深度:无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据两项分数乘积综合判断，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

统计学处理 采用SPSS 18．0统计软件，率的比较采用χ2检验，TNFAIP3和Maspin mRNA中度及强阳性表达率与临床病理参数的相关性采用Φ系数［11］，Φ值越接近1，相关性强度越大，P＜0．05为差异有统计学意义。

结果

TNFAIP3在放疗抗拒及放疗敏感鼻咽癌患者中的表达 TNFAIP3 mRNA在放疗抗拒鼻咽癌患者中的中度及强阳性表达率为48．33%，显著高于放疗敏感鼻咽癌患者(27．50%，χ2=4．340，P=0．037)(表1)。

TNFAIP3在放疗抗拒鼻咽癌中的阳性表达定位于细胞质，呈黄色至棕色(图1)。在放疗抵抗鼻咽癌患者中，TNFAIP3 mRNA中度及强阳性表达率随TNM分期递增(χ2=7．781，P=0．005，关联强度为0．360);有远处转移者中度及强阳性表达率显著高于无远处转移者(χ2=5．640，P=0．018)(表2)。

Maspin在放疗抗拒及放疗敏感鼻咽癌患者中的表达 Maspin mRNA在放疗抗拒鼻咽癌患者中的中度及强阳性表达率为46．67%，显著低于放疗敏感鼻咽癌患者(67．50%，χ2=4．209，P=0．040)(表1)。

Maspin在放疗抗拒鼻咽癌中的阳性表达定位于细胞质，呈黄色至棕色(图2)。在放疗抵抗鼻咽癌患者中，Maspin mRNA中度及强阳性表达率与TNM分期呈正相关(χ2=4．250，P=0．039，关联强度为0．266); 随T分期递增(χ2=5．350，P=0．021，关联强度为0．299);有远处转移者中度及强阳性表达率显著高于无远处转移者(χ2=4．051，P=0．044)(表2)。

表1 TNFAIP3和Maspin mRNA在放疗抗拒及放疗敏感鼻咽癌患者中的表达Table 1 TNFAIP3 and Maspin mRNA expressions in radioresistant and radiosensitive nasopharyngeal carcinoma patients

讨论

TNFAIP3基因cDNA全长4426 bp，可读框2370 bp，转录产物mRNA全长约410 kb，其5’上游具有多个保守的核转录因子结合位点。在MALT淋巴瘤中，启动子甲基化是TNFAIP3失活的替代机制，除基因缺失和突变外，启动子甲基化、半合缺失和突变、纯合性缺失均可使等位基因失活［12］。

图1 T2N1M0Ⅱ低分化鳞癌TNFAIP3阴性表达(A)和T2N1M0Ⅲ低分化鳞癌TNFAIP3强阳性表达(B)(DAB，×400)Fig 1 TNFAIP3 negative expression in T2N1M0Ⅱpoorly differentiated squamous carcinoma(A)and strongly positive expression in T2N1M0Ⅲpoorly differentiated squamous carcinoma(B)(DAB，×400)

图2 T2N1M0Ⅱ低分化鳞癌Maspin弱阳性表达(A)和T3N3M0Ⅲ低分化鳞癌Maspin中度阳性表达(B)(DAB，×400)Fig 2 Maspin weakly positive expression in T2N1M0Ⅱ poorly differentiated squamous carcinoma(A)and moderately positive expression in T3N3M0Ⅲpoorly differentiated squamous carcinoma(B)(DAB，×400)

表2 TNFAIP3和Maspin与放疗抗拒鼻咽癌临床病理参数的相关性Table 2 Relationship of TNFAIP3 and Maspin with clinicopathological parameters of radioresistant nasopharyngeal carcinoma patients

Maspin可作用于纤维母细胞生长因子和血管内皮生长因子，阻断细胞的有丝分裂和管道形成，抑制培养的内皮细胞向基质转移，抑制血管的生长［13］。启动子区CpG岛异常甲基化可能是Maspin基因在肿瘤组织中失活的重要途径［14］。

本研究发现，在放疗抗拒及放疗敏感鼻咽癌中，TNFAIP3 mRNA中度及强阳性表达率分别为48．33% 和27．50%，Maspin mRNA中度及强阳性表达率分别为46．67%和67．50%，差异均有统计学意义。上述结果提示TNFAIP3可能参与放疗抗拒鼻咽癌的发生，其机制可能是通过使慢性炎症刺激因子持续存在，控制炎症的调控机制发生改变，引起放疗抗拒鼻咽癌细胞发生失控性生长。另一方面，Maspin可能增加了鼻咽癌的放疗敏感性，其在放疗敏感鼻咽癌细胞中的可能机制是:Maspin抑制肿瘤血管生成，抑制组蛋白去乙酰化，Maspin转录激活，协同细胞凋亡相关基因Bax促使肿瘤细胞凋亡;Maspin作为一种抑癌基因发挥作用，促进癌细胞凋亡，增加细胞黏附，抑制细胞外基质降解［8-9，15-16］。

本研究显示，在放疗抗拒鼻咽癌中，TNFAIP3 mRNA中度及强阳性表达率与TNM分期呈正相关，有远处转移者该表达率显著高于无远处转移者。TNFAIP3通过影响鼻咽癌微环境中的免疫细胞、炎性细胞，在周围产生生长因子、细胞趋化因子和基质降解酶，降低细胞黏附作用，参与放疗抗拒鼻咽癌的侵袭和转移［16］。此外，Maspin mRNA中度及强阳性表达率与TNM分期和T分期呈正相关，有远处转移者表达率显著高于无远处转移者。Maspin启动子区CpG岛甲基化，抑制启动子区域的转录因子活性，放疗抗拒鼻咽癌细胞Maspin基因沉默，Maspin参与放疗抗拒鼻咽癌的发展［10，16］。

放射线辐射使DNA发生损伤，调控DNA损伤修复中起重要作用的NF-κB，影响细胞生存信号通路，产生单个碱基变异和TNFAIP3单核苷酸多态性，慢性炎症刺激因子持续存在，引起自身免疫功能紊乱，促进肿瘤细胞的持续生长。DNA分子内核苷酸碱基的改变导致结构蛋白改变，Maspin基因突变;免疫组织化学显示，Maspin蛋白定位于细胞质提示预后不良［5-6］。本研究原位杂交检测显示，Maspin mRNA定位于细胞质。Maspin可能参与放疗抗拒鼻咽癌的侵袭和转移，或者TNFAIP3与Maspin有相同的转录因子结合位点，共同参与放疗抗拒鼻咽癌的发展。

综上，既往研究认为，TNFAIP3和Maspin均可抑制肿瘤细胞的生长［2-3，15］。本研究显示，TNFAIP3在肿瘤细胞中的作用具有双重性，放疗敏感鼻咽癌细胞中的TNFAIP3表现出一定的抗肿瘤效应，患者预后良好;但TNFAIP3参与了放疗抗拒鼻咽癌的发生和发展，TNFAIP3对肿瘤细胞凋亡的调节可能有细胞类型特异性。Maspin则可能促进放疗抗拒鼻咽癌的侵袭和转移。在放疗抗拒鼻咽癌中，TNFAIP3和Maspin可能通过相同的转录因子结合位点，共同参与放疗抗拒鼻咽癌的进展过程，其具体机制尚有待进一步研究。

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Expressions of Tumor Necrosis Factor alpha-induced Protein 3 and Mammary Serine Protease Inhibitor in Radiotherapy of Nasopharyngeal Carcinoma

DENG Xiang-qun1，HE Yin-ni2，YE Xu3

1Department of Histology and Embryology，2Department of Phylaxiology，Shaoyang Medical College，Shaoyang，Hunan 422000，China3Department of Nuclear Medicine，Hunan Provincial Tumor Hospital，Changsha 410013，China

Objective To study the expressions of tumor necrosis factor alpha-induced protein 3(TNFAIP3) and mammary serine protease inhibitor(Maspin)in the radiotherapy of nasopharyngeal carcinoma and explore the differences in radiosensitivity and radioresistance，the relation with the occurrence and development of radioresistance．Methods The TNFAIP3 and Maspin mRNA expressions were detected by using TNFAIP3 and Maspin multi-point labeled DIG probes in situ hybridization．Results In radiosensitivity and radioresistance of nasopharyngeal carcinoma，the moderately and strongly positive TNFAIP3 mRNA expression rates were 27．50%and 48．33% (P=0．037)，and the moderately and strongly positive Maspin mRNA expression rates were 67．50%and 46．67% (P=0．040)．In the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma，TNFAIP3 mRNA moderately and strongly positive expressions were positively correlated with TNM stage(P=0．005)．In distant metastasis and no distant metastasis(70．00%and 37．50%，P=0．018)，the expression rates had statistical significance．The Maspin mRNA moderately and strongly positive expressions were positively correlated with TNM stage(P=0．039)and T stage(P=0．021)．In distant metastasis and no distant metastasis(65．00%and 37．50%，P=0．044)，the expression rates had statistical significance．Conclusion TNFAIP3 may be involved in the development of radioresistant nasopharyngeal carcinoma，and Maspin may be related with the invasion and metastasis of radioresistant nasopharyngeal carcinoma．

tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 gene;mammary serine protease inhibitor gene;radiotherapy;nasopharyngeal carcinoma

DENG Xiang-qun Tel:0739-5305006，E-mail:hnsydxq@126．com

R739．63

A

1000-503X(2015)03-0279-06

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．006

2014-11-02)

邓香群 电话:0739-5305006，E-mail:hnsydxq@126．com

湖南省科技厅科技计划项目(2011FJ4141)Supported by the Science and Technology Program of Hunan Provincial Department of Science and Technology(2011FJ4141)