可控酶法制备河蚬抗氧化肽工艺优化

刘晶晶 金林烽 韩曜平 王雪锋 戴阳军

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

生物活性肽分布很广泛，人们已从各种食品原料中鉴定出具有不同功能的生物活性肽（如抗氧化、抑菌、抗癌、改善免疫调节、提高人体耐力），使得对肽的研究日趋升温［1］。其中，对抗氧化肽的研究更是炙手可热，近年来，已从水产蛋白（鳞鱼、鲭鱼、巨鱿鱼皮、白虾头和黄鳍金枪鱼骨架蛋白）中提取了具有显著抗氧化活性的肽段［2］。

河蚬（Corbicula fluminea），又称黄蚬、金蚶、扁螺等，广泛分布于中国内陆水域，是中国重要的经济贝类之一。河蚬含有丰富的蛋白质、糖原、必需氨基酸、牛磺酸、多种维生素以及钙、磷、铁、硒等具有特殊生理作用的矿物质［3］。由于河蚬所具有的营养、药用及食疗价值，对河蚬的开发研究越来越受到国内外专家和学者的关注。邱春江等［4］研究发现花蚬的酶解物具有较强的清除羟自由基能力。刘杰等［5］研究发现河蚬的酶解液具有显著的清除超氧阴离子自由基和羟自由基作用。张磊等［6］发现河蚬提取物可能对酒精性肝损伤有保护作用。吴立峰等［7］报道河蚬糖蛋白对小鼠化学性肝损伤有保护作用。王一铮等［8］研究发现河蚬汤对小鼠急性乙醇肝损伤的保护作用。J.S.Tsai等［9］研究发现河蚬肌肉蛋白水解物对血管紧张素Ⅰ转换酶具有一定的抑制作用。可见，目前河蚬的研究主要集中于提取物和酶解液在抗氧化、护肝及降血压等功效方面的研究，而对河蚬抗氧化肽的可控酶解制备方面的研究未见报道。本试验拟采用可控酶解法制备河蚬抗氧化肽，旨为开发新型抗氧化剂、抗衰老功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

速冻河蚬肉：江苏省宿迁楠景水产品有限公司；

碱性蛋白酶（酶活2.0×105U/g）、中性蛋白酶（酶活2.0×105U/g）、木瓜蛋白酶（酶活8.0×105U/g）、复合风味蛋白酶（酶活1.5×104U/g）和菠萝蛋白酶（酶活6.0×105U/g）：分析纯，上海奥宇生物科技有限司公司；

氢氧化钠、邻二氮菲、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和H2O2：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：EL104型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

冰箱：BCD－216TDXZA型，青岛海尔股份有限公司；

分光光度计：722型，上海菁华科技仪器有限公司；

离心机：80－2型，金坛市荣华仪器制造有限公司；

水浴锅：HHS－11－2型，江苏金坛宏凯仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

（1）酶种类的筛选：将河蚬肉流水解冻，按1∶3（m∶V）的料液比加水后用组织捣碎机匀浆，分别添加0.75%的不同种类蛋白酶，在各自最适的温度和pH条件下（见表1）水解4h，100℃灭酶20min，4 000r/min离心30min，取上清液测定羟自由基清除率并进行比较，从而筛选合适的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶最适酶解条件Table 1 The optimum hydrolysis conditions of proteases

（2）料液比对羟自由基清除率的影响：将河蚬肉流水解冻，按照不同料液比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，m∶V）匀浆，分别加入0.75%的中性蛋白酶，调节pH为7.0，于48℃的恒温水浴锅中酶解4h，100℃灭酶20min，4 000r/min离心30min，得到不同料液比的河蚬抗氧化肽，取上清液测定羟自由基清除率并进行比较，从而筛选合适的料液比。

（3）pH对羟自由基清除率的影响：将河蚬肉流水解冻，按照料液比1∶2（m∶V）进行匀浆，调节不同pH（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0），分别加入0.75%的中性蛋白酶，于48℃的恒温水浴锅中酶解4h，100℃灭酶20min，4 000r/min离心30min，得到不同pH条件的河蚬抗氧化肽，取上清液测定羟自由基清除率并进行比较，从而筛选合适的pH。

（4）加酶量对羟自由基清除率的影响：将河蚬肉流水解冻，按照料液比1∶2（m∶V）进行匀浆，加入不同比例的中性蛋白酶（0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%），调节 pH为6.5，于48℃的恒温水浴锅中酶解4h，100℃灭酶20min，4 000r/min离心30min，得到不同加酶量的河蚬抗氧化肽，取上清液测定羟自由基清除率并进行比较，从而筛选合适的加酶量。

（5）酶解温度对羟自由基清除率的影响：将河蚬肉流水解冻，按照料液比1∶2（m∶V）进行匀浆，调节pH为6.5，再加入0.75%的中性蛋白水解酶，于不同温度（28，38，48，58，68℃）下酶解4h，100 ℃灭酶20min，4 000r/min离心30min，得到不同水解温度的河蚬抗氧化肽，取上清液测定羟自由基清除率并进行比较，从而筛选合适的酶解温度。

（6）酶解时间对羟自由基清除率的影响：将河蚬肉流水解冻，按照料液比1∶2（m∶V）进行匀浆，调节pH为6.5，加入0.75%的中性蛋白酶，于48℃的恒温水浴锅中分别酶解1，2，3，4，5h，100 ℃灭酶20min，4 000r/min离心30min，得到不同酶解时间的河蚬抗氧化肽，取上清液测定羟自由基清除率并进行比较，从而筛选合适的酶解时间。

1.2.2 羟自由基清除率的测定 参照赵谋明等［10］的方法。清除率按式（1）进行计算：

式中：

c——清除率，%；

A1——样品管在波长536nm处的吸光值；

A2——用去离子水代替样品液后，在波长536nm处的吸光值；

A3——用去离子水代替样品液和 H2O2溶液，在波长536nm处的吸光值。

1.2.3 数据统计分析 所有试验至少3次重复，用 Microsoft Excel进行数据整理，不同平均值之间用SPSS 11.5统计软件中的邓肯氏多重比较法（duncan's multiple range test）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶种类的筛选试验 由图1可知，采用5种蛋白酶制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率的影响存在显著性的差异，其中采用菠萝蛋白酶制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率最低，仅有46.00%，而中性蛋白酶制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率最高，达70.20%，故本试验采用中性蛋白酶来制备河蚬抗氧化肽。

图1 酶种类的筛选试验结果Figure 1 The results of different protease effect

2.1.2 料液比对羟自由基清除率的影响 由图2可知，酶解液对羟自由基清除率随料液比增大而呈下降趋势，数据经分析得出料液比为1∶1与1∶2（m∶V）的酶解物对羟自由基清除率没有显著性差异。而考虑到试验操作测定的便利性，本试验采用1∶2（m∶V）的料液比进行试验。

图2 料液比对羟自由基清除率的影响Figure 2 Effect of solid－liquid ratio on hydroxyl radical scavenging

2.1.3 pH对羟自由基清除率的影响 由图3可知，在不同的pH条件下制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率具有显著性差异，在pH为6.0～6.5时，曲线呈上升趋势，而当pH调节到6.5时其羟自由基清除率可达到最高值79.60%，在pH为6.5～8.0时，曲线又呈下降趋势，确定中性蛋白酶的最适pH为6.5。

图3 pH对羟自由基清除率的影响Figure 3 Effect of pH on hydroxyl radical scavenging

2.1.4 加酶量对羟自由基清除率的影响 由图4可知，羟自由基清除率随加酶量的增大而升高，因为在底物浓度一定的情况下，蛋白酶的含量越高，其酶解越充分，从而导致酶解制备的抗氧化肽对羟自由基清除率呈上升的趋势。但当加酶量超过0.75%时，不同加酶量的酶解产物对羟自由基清除率没有显著性差异，结合成本考虑，选用添加0.75%的中性蛋白酶。

图4 加酶量对羟自由基清除率的影响Figure 4 Effect of the amount of enzyme on hydroxyl radical scavenging

2.1.5 酶解温度对羟自由基清除率的影响 由图5可知，不同温度条件下制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率存在显著性差异，其中48℃时抗氧化肽对羟自由基清除率最高，达到了75.00%。因为蛋白酶具有最适反应温度，在48℃时，中性蛋白酶活性最强，酶解液清除羟自由基的能力最强。低于或高于48℃时，酶活力下降，酶解液清除羟自由基的能力也随之下降。故选用48℃为河蚬抗氧化肽的最佳酶解温度。

图5 酶解温度对羟自由基清除率的影响Figure 5 Effect of the enzymatic temperature on hydroxyl radical scavenging

2.1.6 酶解时间对羟自由基清除率的影响 由图6可知，酶解产物对羟自由基清除率随酶解时间的增加而增大，在酶解时间为1～3h时，羟自由基清除率呈明显的上升趋势，而在3h后曲线的上升趋势明显缓慢，且酶解时间为3h和4h时，羟自由基清除率没有显著性差异。这是由于酶解初期，酶量充足，酶解速度较快，酶解液中抗氧化肽含量上升较快；一定时间后，酶解速度缓慢，且随着水解时间的延长，抗氧化肽含量增加不明显，故酶解时间选用3h为宜。

图6 酶解时间对羟自由基清除率的影响Figure 6 Effect of hydrolysis time on hydroxyl radical scavenging

2.2 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，采用Design－Expert 7.1.3软件中的Box－Behnken试验设计原理［11，12］，固定料液比为1∶2（m∶V），选取对河蚬酶解工艺具有显著影响的因素：酶解温度、pH、酶解时间和加酶量进行4因素3水平的试验设计，各因素水平编码表见表2，试验结果见表3。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and level of experiment by response surface

表3 响应面试验结果Table 3 Experimental results of response surface

2.2.1 方差分析 使用软件对结果进行分析处理，得到结果见表4。

表4 回归方程显著性检验和方差分析Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

表4 回归方程显著性检验和方差分析Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

＊＊表示极其显著，P＜0.001；＊表示显著，P＜0.05。

来源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 显著性模型 0.07 14 5.03E－03 5.20 0.000 2 ＊＊A 0.021 1 0.021 21.97 0.000 3 ＊＊B 1.20E－03 1 1.20E－03 1.24 0.284 1 C 4.14E－03 1 4.14E－03 4.28 0.057 4 D 0.02 1 0.02 20.86 0.000 4 ＊＊AB 1.96E－04 1 1.96E－04 0.20 0.659 5 AC 1.85E－03 1 1.85E－03 1.91 0.188 4 AD 3.91E－03 1 3.91E－03 4.04 0.044 2 ＊BC 1.00E－04 1 1.00E－04 0.10 0.752 6 BD 1.94E－03 1 1.94E－03 2.00 0.179 0 CD 7.02E－04 1 7.02E－04 0.73 0.408 5 A2 6.98E－03 1 6.98E－03 7.22 0.017 7 ＊B2 5.47E－04 1 5.47E－04 0.57 0.464 5 C2 2.23E－03 1 2.23E－03 2.31 0.150 8 D2 0.01 1 0.01 10.56 0.005 8 ＊残差0.014 14 9.67E－04失拟 0.012 10 1.16E－03 2.33 0.215 5误差 1.99E－03 4 4.96E－04总和0.084 28

表5 去掉不显著项后的优化结果Table 5 The optimization results of excluding

表5 去掉不显著项后的优化结果Table 5 The optimization results of excluding

＊＊表示极其显著，P＜0.001；＊表示显著，P＜0.05。

来源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 显著性模型 619.63 6 103.27 10.34 ＜0.000 1 ＊＊A 212.52 1 0.021 21.97 0.000 1 ＊＊C 41.44 1 41.44 4.75 0.043 8 ＊D 201.72 1 201.72 20.20 0.000 2 ＊＊AD 39.06 1 39.06 4.43 0.004 5 ＊A2 55.65 1 55.65 5.57 0.027 5 ＊D2 85.86 1 85.86 8.60 0.007 7 ＊残差219.75 22 9.99失拟 199.90 18 11.11 2.24 0.226 7误差 19.85 4 4.96总和839.38 28

手动优化后的二次回归方程为：

手动调整后的变异系数（C.V.%）为4.20，小于5.0，所以整个试验的模型稳定性较强，试验设计较为合理。

对结果影响较强的交互项响应曲面图见图7。

图7 酶解温度与加酶量对羟自由基清除率影响的响应曲面和等高线Figure 7 Response surface plot and contour plot for effects of the amount of enzyme and temperature and their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

由表4可知：模型中F值为5.2，P值为0.002＜0.05，因此回归方程对羟自由基清除率具有较高显著性，而且模型中的失拟项P值为0.215 5＞0.05（不显著）表示该模型是比较稳定的［13］，可以很好地解释分析响应结果并能正确预测最佳工艺条件。单因素中温度、加酶量对羟自由基清除率的影响是极其显著（P＜0.001）；交互因素中温度与加酶量对羟自由基清除率的影响显著（P＜0.05）。

2.2.2 回归模型优化 将不显著项手动删除，见表5。

由图7可知，加酶量与温度相互作用对羟自由基清除率的影响显著（P＜0.05），其等高线中心呈较完整的椭圆形，峰值出现在温度55℃与加酶量0.70%～0.90%，并且当温度一定时，并非加酶量越多酶解效果越好，因此适量添加蛋白酶不仅能够达到最优酶解效果，而且工厂化生产后可以节约部分成本。

通过Design－Expert 7.1.3软件计算分析并预测出最优工艺条件为：温度54.70℃，pH 6.00，酶解时间3.91h，中性蛋白酶的加酶量为0.94%，理论预测值羟自由基清除率为83.34%。

2.3 验证实验

根据Design－Expert 7.1.3软件计算出的最优工艺条件：料液比为1∶2（m∶V），添加0.94%中性蛋白酶，在pH为6.00，温度为54.70℃的条件下酶解3.91h，实际测得酶解制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率为81.63%，与理论预测值相差1.71%，可见模型预测值在实际值的误差范围之内，说明该模型可以用来优化制备河蚬抗氧化肽。

3 结论

（1）在单因素试验基础上，通过Box－Behnken试验设计和响应面分析法，经过分析建立二项数学模型，确定最佳酶解工艺条件为料液比1∶2（m∶V），中性蛋白酶的添加量0.94%，酶解时间3.91h，酶解温度54.70℃和pH 6.00，模型预测该条件下羟自由基清除率为83.34%，而实际测定值为81.63%，属于试验误差范围内，因此，利用该模型来优化河蚬抗氧化肽的酶法制备工艺参数准确、可靠，具有实用价值。

（2）利用可控酶解技术对河蚬蛋白进行深度开发，该工艺条件下制备的河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率较高，为制备新型抗氧剂和具有抗氧化功效的富肽酶解物并开发系列功能食品提供理论依据，为河蚬的深度加工提供一条新的途径。

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