基于灰色关联分析法的大豆蛋白酶解工艺优化

曲玲玲 郭长慧 刘丽洁 张 娜（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.黑龙江省食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

大豆蛋白经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程得到蛋白质水解产物，该水解产物由多种肽混合组成，其中还含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分［1－3］。水解产物具有降血压、抗氧化、减肥及促进矿物质吸收等多种生理功能，使其在食品工业上具有广阔的开发应用前景［4－6］。

中国对大豆多肽的研究起步较晚，基础和应用研究都很薄弱，尚处于初级开发应用阶段，具有极大市场潜力。本研究采用的豆粕是豆油加工的副产品，成本低廉，来源广泛。目前豆粕主要用作饲料，在食品方面应用极少，而且只限于酿造食品。脱脂豆粕中蛋白含量较高（45%～50%），氨基酸平衡，且较大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白价格便宜，因此利用豆粕加工大豆多肽有很高的开发和利用价值［7，8］。

灰色关联分析是灰色系统理论的基础，实质上是关联系数的分析，目的是寻求系统中各因素间的主要关系、找出影响目标值的重要因素，从而掌握事物的主要特征，促进和引导系统迅速而有效地发展。自1982年邓聚龙教授［9］创立灰色系统理论以来，灰色关联分析已成功应用于聚类、预测、决策、评估、模式识别、系统指标权重确定、建模精度检验及诊断等方面［10－13］。在对复杂系统进行分析时，以往多采用统计分析或其它分析法，灰色关联分析法与之相比的优势在于：灰色关联分析是按发展趋势做分析，因此对样本量的多少没有过多的要求，也不需要典型的分布规律，而且计算量比较小，其结果与定性分析结果比较吻合。目前灰色关联分析在食品方面的应用较少，其不仅是优势分析的基础，还是进行科学决策的依据［14］。

为了提高大豆蛋白资源的利用率，降低大豆肽的生产成本，提高大豆肽的水解度，获得具有高溶解度、低黏度等优良加工特性的大豆肽。黄雅燕等［15］曾运用正交试验对碱性蛋白酶水解豆粕制备大豆多肽的工艺条件进行优化。本研究拟利用Alcalase碱性蛋白酶水解大豆脱脂豆粕，测定低温豆粕中的蛋白含量、水解度，选用灰色关联分析法对大豆蛋白酶解过程进行工艺优化，建立不同条件下水解制备大豆蛋白水解模型，以利用该模型在一定范围内预测大豆蛋白酶解程度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆脱脂豆粕粉：哈高科大豆食品有限责任公司；

Alcalase（2.4LFG）酶：酶活4.4万 U/g，丹麦诺维信公司；

氢氧化钠、甲醛：分析纯，天津市大陆化学试剂厂；

盐酸：分析纯，西陇化工有限公司；

福林酚：分析纯，天津光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：YB－10002型，上海光正医疗仪器有限公司；

电子分析天平：e－10d型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

真空干燥箱：DZF－6020型，上海一恒科学仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：DK－98－IIA型，天津泰斯特仪器有限公司；

分光光度计：722型，上海佑科仪器仪表有限公司；

台式离心机：TDL80－2B型，上海安亭科学仪器厂；

pH计：PHS－3C型，上海精密仪器有限公司；

万用电炉：DL－1型，北京市永光明医疗仪器有限公司；

架盘天平：HC－TP11－5型，上海精科天平。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白的酶解 准确称取 Alcalase（2.4LFG）酶0.340 9g，用蒸馏水定容至100mL，准确吸取1mL，用蒸馏水定容至100mL。称取脱脂豆粕10g，加水配成5%（m/V）的悬浊液，搅拌分散，用1.0mol/L HCl调pH 值为4.5，45℃洗糖60min，再抽滤，取固体物质再次搅拌溶解配成5%（m/V）的悬浊液，用1.0mol/L HCl调 pH 值为4.5，45℃洗糖30min，再抽滤，取固体物质再次搅拌溶解配成5%（m/V）的悬浊液，反应过程中用5%NaOH溶液维持系统pH值恒定（±0.10），加酶1mL，升温至55℃保温酶解3h，抽滤取上清液，再升温至100℃保温灭酶10min，冷却后，抽滤，再将上清液浓缩干燥，得到大豆蛋白水解物。

1.3.2 酶活的测定 采用福林酚法［16］。

1.3.3 大豆蛋白酶解的单因素试验

（1）pH值对脱脂豆粕酶解的影响：固定时间为3h，温度为55℃，加酶量为1 500U/g，底物浓度为3%（m/V），分别在pH 值为8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的条件下，测定水解后上清液中的蛋白质含量和水解度。

（2）温度对脱脂豆粕酶解的影响：固定时间为3h，pH值为9.0，加酶量为1 500U/g，底物浓度为3%（m/V），分别在温度为45，50，55，60，65℃的条件下，测定水解后上清液中的蛋白质含量和水解度。

（3）时间对脱脂豆粕酶解的影响：固定温度为55℃，pH值为9.0，加酶量为1 500U/g，底物浓度为3%（m/V），分别在时间为1，2，3，4，5h的条件下，测定水解后上清液中的蛋白质含量和水解度。

（4）加酶量对脱脂豆粕酶解的影响：固定温度为55℃，pH值为9.0，时间为3h，底物浓度为3%（m/V），分别在加酶量为500，1 000，1 500，2 000，2 500U/g的条件下，测定水解后上清液中的蛋白质含量和水解度。

（5）底物浓度对脱脂豆粕酶解的影响：固定温度为55℃，pH值为9.0，时间为3h，加酶量为1 500U/g，分别在底物浓度（m/V）为3%，4%，5%，6%，7%的条件下，测定水解后上清液中的蛋白质含量和水解度。

1.3.4 制备工艺的优化 在单因素试验结果的基础上，选取温度、加酶量、pH值、时间、底物浓度5个因素，利用DPS数据处理软件中“灰色系统方法关联度分析”程序进行试验方案设计，并对所得数据进行分析处理。

（1）灰色关联分析原始数据变换：由于系统中各因素的量纲可能不同，数值的数量级也可能相差悬殊，很难直接进行比较。因此，本试验采取均值化变换，先分别求出各个序列的平均值，再用平均值去除对应序列中的各个原始数据，所得到的新数据列，即为均值化序列。其特点是量纲为一，其值大于0，并且大部分近于1，数列曲线互相相交。经过数据变换的母数列记为｛Y（t）｝，子数列记为｛Xi（t）｝［17］。

（2）关联系数分析：关联系数反映两个被比较序列在某一时刻的紧密程度，关联系数的范围为0＜L≤1。经数据变换的母数列记为｛Y（t）｝，子数列记为｛Xi（t）｝，则在时刻t＝k时母序列｛Y（k）｝与子序列｛Xi（k）｝的关联系数L0i（k），按式（1）计算：

式中：

L0i（k）——关联系数；

Δ0i（k）——k时刻两比较序列的绝对差，即 Δ0i（k）＝｜Y（k）－Xi（t）｜；

Δmin——所有比较序列各个时刻绝对差中的最小值；

Δmax——所有比较序列各个时刻绝对差中的最大值；

ρ——分辨系数，取ρ＝0.5。

1.3.5 多元回归分析 采用SPSS 19.0软件中“回归分析”程序分析底物浓度、加酶量、温度、pH值、时间的回归方程。

1.3.6 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法［18］。

1.3.7 水解度的测定 采用甲醛滴定法［19－21］。

2 结果与分析

2.1 大豆蛋白酶解单因素试验结果

2.1.1 pH值对低温豆粕酶解的影响 由图1可知，随着pH值的增大，大豆蛋白水解度呈现先增加后趋于平缓的变化趋势。pH值为9.0时，大豆蛋白水解度达到13.31%。pH值为8.0～9.0时处于酶的最适pH，酶活力较大，随pH值增加水解度增加；超过9.0后，酶虽未变性，但pH会影响底物的游离状态，也会影响酶分子活性部位上有关基团的解离，进而影响酶与底物的结合与催化，使水解度变化趋于平缓［22］。权衡水解度、环境条件和试剂用量对产率的影响，选择9.0作为最佳酶解环境的pH值。

图1 pH值对水解度的影响Figure 1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.2 温度对低温豆粕酶解的影响 由图2可知，温度由45℃增大到55℃时，大豆蛋白水解度出现增长趋势；温度为55℃时，大豆蛋白水解度达到12.68%；超过55℃之后，大豆蛋白水解度呈现降低的趋势。这是由于在低温阶段酶活力较小，酶水解速度较低，在适宜温度下，有利于蛋白结构的舒展，肽键更易与酶结合，酶水解速度加快，随着温度继续升高，酶蛋白变性失活，导致水解度下降［23］。权衡水解度、环境条件以及试剂用量对产率的影响，选择55℃作为最佳酶解环境的温度。

图2 温度对水解度的影响Figure 2 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3 时间对低温豆粕酶解的影响 由图3可知，随着时间的延长，大豆蛋白水解度呈现先增长后趋于平稳的变化趋势。时间为3h时，大豆蛋白水解度达到13.24%。原因主要是由于Alcalase蛋白酶酶解需要一定的反应时间，随着酶解反应的进行，酶与底物作用，水解程度不断加深，水解度也随之提高；在到达3h时，底物浓度减少，反应位点逐渐被酶分子饱和，可与酶作用的肽键数量减少，并且产物浓度增加，其竞争性抑制增强，酶的活性逐渐降低，因此出现先增长后趋向平稳的变化过程［24］。权衡水解度、环境条件以及试剂用量对产率的影响，选择3h作为最佳酶解环境的时间。

图3 时间对水解度的影响Figure 3 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.1.4 加酶量对低温豆粕酶解的影响 由图4可知，加酶量由500U/g增大到2 000U/g时，大豆蛋白水解度逐渐增长；加酶量为2 000U/g时，大豆蛋白水解度达到14.61%，之后，大豆蛋白水解度呈略微降低的变化趋势。这是由于Alcalase蛋白酶酶解初期，酶浓度较低，底物过量，酶与底物完全结合，水解程度逐渐增大，水解度随之呈现上升趋势，在加酶量达到2 000U/g时酶在底物表面的作用已达到饱和，酶分子与底物不能充分接触，而底物上可供酶切割的位点有限，多出的酶不能在底物上起作用［25］，因此水解度趋于平衡，有略微降低的趋势［25］。因此，权衡产率、成本等相关因素，选择2 000U/g作为最佳酶解环境的加酶量。

图4 加酶量对水解度的影响Figure 4 Effect of the enzyme added of the degree of hydrolysis

图5 底物浓度对水解度的影响Figure 5 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

2.1.5 底物浓度对低温豆粕酶解的影响 由图5可知，随着底物浓度的增大，大豆蛋白水解度呈现先增长后逐渐趋于平稳的变化趋势。底物浓度为5%（m/V）时，大豆蛋白水解度达到10.66%。这是因为在一定的加酶量条件下，底物浓度的增加会导致酶解的效率增加，使得所有的酶都可以在同一时间作用于底物，导致水解度不断上升，当加酶量和底物相互平衡时达到酶解的最大效率，再增加底物浓度，酶解效率几乎不变，导致水解度基本保持不变的状态［26］。权衡水解度、环境条件以及试剂用量对产率的影响，选择5%（m/V）作为最佳酶解环境的底物浓度。

2.2 灰色关联分析

2.2.1 原始数据变换 利用DPS数据处理软件中“灰色系统方法关联度分析”程序，得到原始数据均值化结果见表1。

2.2.2 关联系数分析 由原始数据均值化结果得到所有比较序列各个时刻绝对差中最小差值Δmin和最大差值Δmax分别为0和0.481 65，利用DPS数据处理软件中“灰色系统方法关联度分析”程序计算反应体系中各因素的关联系数。根据不同因素的关联系数（表2），排列出因素的显著性为：pH值＞温度＞底物浓度＞加酶量＞时间，因此大豆多肽的制作工艺参数中，pH值影响最显著，时间的影响最不显著。

2.3 多元回归分析

采用SPSS 19.0软件进行回归分析，以水解度为因变量，pH值、温度、底物浓度、加酶量、时间为自变量建立多元线性回归方程［27］。运用SPSS 19.0软件中“分析—回归—线性”程序，得到回归方程为：

根据回归方程（2），可以预测反应体系pH值为8～10、温度为45～65℃、时间为1～5h、底物浓度为3%～7%（m/V）以及加酶量为500～2 500U/g内的Alcalase碱性蛋白酶酶解大豆低温豆粕的水解度。

表1 原始数据均值化结果Table 1 The average of the results of the original data

表2 反应体系中各因素关联系数Table 2 Correlation coefficient of various factors in the reaction system

2.4 验证实验

为了验证多元回归分析线性回归方程的可靠性，随机假设3组Alcalase碱性蛋白酶酶解大豆低温豆粕的反应条件，将方程预测的水解度和实测的水解度进行比较，结果见表3。由表3可知，预测的水解度和实测的水解度数值基本接近，表明预测值与真实值之间有很好的拟合性，因此灰色关联分析方法得到的优化工艺参数准确可靠，具有实用性。

表3 随机降解条件验证实验Table 3 Random degrading conditions of validation experiments

3 结论

本试验对Alcalase碱性蛋白酶酶解大豆蛋白过程进行优化，以水解度为指标，确定大豆多肽酶解的最佳工艺参数为：反应体系pH值9.0，反应温度55℃，反应时间3h，大豆脱脂豆粕添加量5%（m/V），Alcalase碱性蛋白酶的添加量2 000U/g，该条件下水解度为13.53%。本试验使得大豆蛋白水解度得到了较大提高，下一步将对大豆蛋白水解产物的生理功能与水解度之间的关系进行更深入的研究。

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