中药药渣发酵生产毛云芝菌漆酶培养基的工艺研究

岳 鹍 潘志恒 孙勇民（天津现代职业技术学院，天津 300350）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是一类含铜多酚氧化酶，真菌漆酶因其来源广泛、催化活性强而具有广泛应用前景和价值［1，2］，但真菌漆酶通常为次级代谢酶，产酶周期长且产酶量低，严重限制了漆酶的工业化生产［3，4］。

中国是中药资源消耗大国，中成药生产、中药饮片炮制、含中药成分轻化工产品生产过程中均有大量药渣产生。中药药渣种类多样、湿度高、处理难度大，目前大部分均采用焚烧或填埋方式进行处理，既造成了中药资源的浪费，又造成了水体、大气的污染。由于中药药渣中含有较丰富的营养成分，如多糖、木质素、氨基酸及微量元素等，部分研究［5，6］表明一些中药药渣可显著促进真菌生长及次级代谢酶的产生，目前仅有利用白芍药药渣固体发酵亮菌产漆酶的研究［7］，未见利用药渣进行液体发酵的相关研究报道。本试验拟以常见中药药渣为研究对象，筛选获得合适中药药渣诱导漆酶产量提高的同时，发挥真菌生物降解作用，充分利用中药渣的生物质资源，使其变废为宝。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

毛云芝菌（Coriolus hirsutus）：由安徽大学生命科学学院提供，4℃下保存于PDA斜面培养基中；

葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、溶性淀粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏：生化试剂，天津市化学试剂一厂；

五水合硫酸铜、硫酸镁、磷酸二氢钾：分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司；

2，2’－联氮二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸盐）（ABTS）：分析纯，Aladdin Chemistry Co.Ltd。

1.1.2 主要仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX－75KBS型，上海申安医疗器械厂；

恒温培养振荡器：ZWYR－2102C型，上海智诚分析仪器制造有限公司；

紫外可见分光光度计：T6系列，北京普析通用仪器有限责任公司；

洁净工作台 ：HCB－1800H型，海尔集团；

电子天平：ME104E型，梅特勒—托利多国际贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基组成及培养条件

（1）液体种子培养基：马铃薯汁30%（m/V），葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然。

（2）摇瓶培养基：小麦麸皮3%（m/V），蛋白胨0.2%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自然。

（3）基础培养条件：在250mL三角瓶中，装液量50mL，接种量10mL，培养温度30℃，转速200r/min，振荡培养12d［8］。

1.2.2 培养时间对毛云芝菌生长及产酶酶活的影响 采用摇瓶培养基，在接种量20%，培养温度30℃，转速200r/min的条件下对毛云芝菌进行培养，每24h取50mL发酵液，分析毛云芝菌生长及产酶酶活随培养时间的变化情况。

1.2.3 中药药渣对产酶的影响 采用基础培养条件，以摇瓶培养基为基础，在摇瓶培养基中分别加入10%（m/V）防风、川芎、当归、芍药、大黄、麻黄、连翘及苍术8种中药渣，比较不同类型中药药渣对毛云芝菌生长及其产酶酶活的影响。

1.2.4 碳源对产酶的影响 采用基础培养条件，以摇瓶培养基 为 基 础，在 蛋 白 胨 0.2% （m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自然的条件下，分别以3%（m/V）的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉及麸皮为碳源，比较不同碳源对毛云芝菌生长及其产酶酶活的影响。

1.2.5 氮源对产酶的影响 采用基础培养条件，以摇瓶培养基为基础，在小麦麸皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然的条件下，分别以0.2%（m/V）的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、花生粉、黄豆粉和尿素为氮源，比较不同氮源对毛云芝菌生长及其产酶酶活的影响。

1.2.6 中药药渣添加量对产酶的影响 采用基础培养条件，以摇瓶培养基为基础，在摇瓶培养基中分别加入6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%（m/V）大黄药渣，比较不同药渣添加量对毛云芝菌生长及其产酶酶活的影响。

1.2.7 碳氮比对产酶的影响 采用基础培养条件，以摇瓶培养基为基础，在小麦麸皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自 然 的 条 件 下，分 别 加 入 0.16%，0.18%，0.20%，0.22%，0.24%，0.26%，0.28%（m/V）蛋白胨，考察不同C/N比对毛云芝菌生长及其产酶酶活的影响。

1.2.8 pH值对毛云芝菌产酶的影响 采用基础培养条件，以摇瓶培养基为基础，在蛋白胨0.2%（m/V），小麦麸皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L的条件下，分别在pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0下进行培养，比较不同pH值对毛云芝菌生长及其产酶酶活的影响。

1.2.9 理化分析方法

（1）菌丝干重的测定：采用干燥称重法［9］。

（2）漆酶活力的测定：采用分光光度法［10］。

2 结果与分析

2.1 培养时间对毛云芝菌生长及产酶酶活的影响

由图1可知，在初始无药渣添加的摇瓶培养基中，1～3d时毛云芝菌处于调整期，此阶段毛云芝菌产酶能力较弱；3～9d时毛云芝菌进入指数生长期，伴随着毛云芝菌的快速生长，其产酶能力也迅速增强；9～12d时毛云芝菌生长逐步进入稳定期，此阶段毛云芝菌产酶能力及酶活逐步达到峰值；培养12d后，毛云芝菌产酶能力随着菌丝体进入衰亡期而逐步降低。因此，根据培养变化曲线确定菌种培养时间为12d。

图1 培养时间对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 1 Effects of culture time on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2 毛云芝菌药渣培养基的优化

2.2.1 中药药渣对产酶的影响 由图2可知，8种中药药渣对毛云芝菌培养影响效果存在明显差异。毛云芝菌漆酶是一种诱导酶，研究［11］表明，漆酶的合成与菌丝体的生长没有明显的相关性，在毛云芝菌生产过程中通常需要添加诱导剂促进漆酶的分泌。常见的诱导剂有小分子芳香化合物、木质素、糖苷类物质及酚类物质等［12］。试验［13］表明，大黄药渣中的土大黄甙、麻黄药渣中的鼠李糖甙及芍药药渣中的芍药甙均能有限促进漆酶的分泌；防风、连翘及苍术药渣中富含的色酮、内酯类物质对漆酶分泌影响不明显；当归、川芎药渣对漆酶的分泌存在明显的抑制作用，这可能是由于当归、川芎药渣中富含的藁本内酯、川芎酽内酯等挥发性油性成分具有明显的抑制真菌活性作用造成的。综合考虑，试验选择大黄药渣作为添加中药药渣。

图2 中药药渣对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 2 Effects of different medicine slag on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

图3 碳源对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 3 Effects of different carbon sources on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.2 碳源对产酶的影响 由图3可知，毛云芝菌利用天然碳源的能力较强，能够生长的基质广泛。从毛云芝菌菌丝体生长情况上看，可溶性淀粉、葡萄糖及蔗糖等作为碳源时，虽促进了毛云芝菌菌丝体生物量的提高，但产酶酶活却很低，这表明毛云芝菌产酶与其菌丝体的生长没有明显的正相关性，选择合适的诱导剂及其用量是漆酶优化工艺中非常重要的步骤。从产酶酶活上比较，麸皮作为碳源的效果明显优于其他碳源，这可能是由于麸皮中富含的木质素类似物、维生素（尤其是B族维生素）均是毛云芝菌漆酶分泌的诱导剂，有效促进了毛云芝菌产酶能力的提高［14］。综合考虑，选择麸皮作为培养基中的碳源。

2.2.3 氮源对产酶的影响 由图4可知，生长在不同氮源培养基上的毛云芝菌菌丝体具有一定差异，毛云芝菌对黄豆粉、蛋白胨及酵母膏的利用能力要优于尿素、牛肉膏和花生粉，这可能是因为蛋白胨、黄豆粉中的部分营养物质可作为碳源被利用，促进了营养平衡和物质转化。

图4 氮源对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 4 Effects of different nitrogen sources on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

但从产酶酶活上比较，蛋白胨、酵母膏及牛肉膏3种氮源的效果要优于其他3种氮源，这主要是由于花生粉、黄豆粉作为慢速氮源，使用时毛云芝菌前期生长速度受到了明显的影响，菌体积累不足，抑制了漆酶的产生。因此，快速氮源——蛋白胨作为培养基的氮源更为合适。

2.2.4 中药药渣添加量对产酶的影响 由图5可知，毛云芝菌生长受大黄药渣添加量的影响不显著；但产酶酶活受到大黄药渣添加量的影响，呈现先增大后减小的趋势，造成这种现象是大黄药渣除了含有诱导漆酶分泌的糖苷类物质，同时还含有一定量的抑制真菌活性的有机酸（酯）类挥发油性成分，当大黄药渣添加量不断增大时，糖苷类物质的诱导作用逐步达到峰值，继续增加药渣添加量，其中挥发油性成分抑制真菌活性的作用逐渐显现，漆酶产量又逐渐下降［15］。因此，综合考虑产酶酶活和药渣添加量，大黄药渣的添加量选择为12%。

图5 药渣添加量对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 5 Effects of different amount of medicine slag on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.5 碳氮比对产酶的影响 由图6可知，培养基的C/N是毛云芝菌产酶的重要影响因素。漆酶作为一种代谢产物，一般在培养基中氮源物质耗尽时才开始分泌；当C/N较小时，毛云芝菌生长过于旺盛，培养基中氮源充足，抑制了漆酶的分泌；当C/N较大时，培养基中氮源不足，毛云芝菌生长不良，不利于漆酶的发酵生产；当C/N为20时，漆酶活力达到最高值。因此，本试验C/N比选择为20。

图6 碳氮比对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 6 Effects of different C/N ratio on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.6 pH值对产酶的影响 由图7可知，当底物的初始pH值为4.5时，漆酶活力达到最高；继续升高初始pH值，漆酶活力也逐渐降低，这主要是由于当pH值小于4.0时，毛云芝菌生长困难，产酶能力也相应降低；pH值超过5.0也出现降低趋势，其原因主要是酸性条件可以抑制细菌的生长，有益于真菌的生长，促进真菌漆酶的分泌。考虑到底物在略偏酸条件下可以抑制细菌的污染，因此云芝菌液体发酵产酶的初始pH值以4.5～5.0为宜。

2.3 优化培养基与原培养基的比较试验

将上述试验优化所得的结果进行组合，初步得到的毛云芝菌药渣培养基的组成为：碳源麸皮3%（m/V），氮源蛋白胨0.2%（m/V），大黄药渣12%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 5.0。利用此培养基与初始摇瓶培养基，在相同培养条件下同时培养12d，比较添加药渣前后毛云芝菌的生长及产酶酶活的差异。

由表1可知，添加了大黄药渣的培养基与初始摇瓶培养基相比，毛云芝菌的生物生长量及产酶酶活均有显著的提高，大黄药渣对毛云芝菌发酵产漆酶存在明显的促进作用。

图7 pH值对毛云芝菌生物量及其产酶酶活的影响Figure 7 Effects of pH on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

表1 优化培养基与原培养基的酶活比较Table 1 Comparison of enzyme activity of laccase cultured in original and optimized medium

3 结论

本试验开展了利用中药药渣促进毛云芝菌漆酶产酶效果的影响研究，通过比较多种常见中药药渣，发现大黄药渣促进毛云芝菌产酶能力及产酶酶活的提高效果最为明显。试验结果表明，毛云芝菌在初步优化的大黄药渣培养基中的产酶酶活较原培养基产酶酶活提高了1.4倍。

中药药渣是中药提取生产过程中的废弃物，处置不当易造成污染环境。然而，中药药渣尤其是根茎类中药药渣中含有大量的木质素、纤维素和功能性成分，具有较大的开发利用价值。目前，中药药渣用于固体发酵技术的研究相对较多，本试验结果表明中药药渣用于液态发酵也同样能取得较好的效果，为中药药渣的综合应用探索了新途径。

本试验目前只初步对各种常见中药药渣进行了筛选，并针对大黄药渣培养基进行了初步优化，后续还将对微量元素、维生素对毛云芝漆酶药渣培养条件的影响进行深入的研究，以期获得更高的产酶酶活。

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