喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清酶的影响

王海潮 张兴桃 董 增 吴 萧（.宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000；2.宿州学院特色种植业苗种生产工程技术研究中心，安徽 宿州 234000）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）属甲壳纲、十足目、方蟹科，又称河蟹，味道鲜美，营养丰富，是一种经济蟹类，是中国传统的名贵水产品之一［1］。近年来，河蟹日益严重的病害问题已成为养蟹产业发展的主要阻碍因素之一。在蟹类疾病防治中，抗菌药物发挥着重要作用，但由于病原微生物的耐药性和机体药物残留等问题，部分药物使用已受到了严格的限制。因此，研究抗菌药物对机体的免疫影响来指导用药就具有十分重要的意义。

喹诺酮类（quinolones）药物具有广谱、高效、低残留、毒副作用小、不易产生耐药性等优点，是常用的临床抗菌药物，也是鱼病防治上公认的理想抗菌药物［2－4］，目前水产上常用的喹诺酮类药物主要有诺氟沙星、氧氟沙星和恩诺沙星等。范红结等［5］报道恩诺沙星对中华绒螯蟹的雷氏普罗威登菌（Providenciarettgeri）敏感度很高；张雅斌等［6］用恩诺沙星对细菌性败血病等5种诺酮类药物几乎对水生动物所有病原菌表现出较强的抗菌作用。喹诺酮类药物对淡水养殖鱼类常见病的病原菌均有较强的抑菌作用；但大量试验［7－10］证明喹诺酮类药物可引发消化系统、神经系统肝肾功能等脏器损害及过敏等不良反应。近年来，为系统评价甲壳动物的免疫水平，研究人员［11－14］先后采用了各种血清酶指标，其中应用较多的有酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、碱性磷酸酶（ALP）、溶菌酶 （LSZ）等。研究［15－17］表明喹诺酮类药物可影响动物免疫力，在低剂量时还对机体免疫系统有促进作用，增强机体免疫功能，增进机体对病原体的吞噬力；巩华等［18］通过投喂恩诺沙星对鲤鱼血清酶的影响，发现高浓度药物（1g/kg）对鲤鱼肝、肾有明显影响。关于抗生素对免疫的影响，除产生免疫抑制外，近年来对部分抗生素的免疫促进作用有较多报道［19］。张丽敏等［20］报道恩诺沙星以20mg/kg腹腔注射红笛鲷，可明显提高红笛鲷血清中抗体IgM的含量，这种作用可持续3周左右，表明恩诺沙星对鱼类体液免疫有良好的促进作用。王海潮等［21］研究过常用抗菌药物对锯缘青蟹体外血清酚氧化酶的影响，但喹诺酮类药物对中华绒螯蟹的体内血清酶的免疫影响未见相关报道。本研究拟以中华绒螯蟹为试验对象，研究3种喹诺酮类药物诺氟沙星、氧氟沙星和恩诺沙星对中华绒螯蟹血清酚氧化酶（PO）、过氧化物酶（POD）、碱性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）等活力指标的影响，旨在为中华绒螯蟹养殖生产中合理用药提供科学依据，并为进一步研究渔用药物的作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

中华绒螯蟹：体质量为（150±30）g，安徽宿州某养殖场提供。选择体色好、步足健全、无外伤的个体，随机分成4组，每组18只，暂养于48cm×37cm×29cm塑料箱中，试验期间水温（23±2）℃，盐度19.5‰。

1.2 仪器与试剂

酶标仪：VersaMax型，美国 Molecular Devices Corporation（MDC）公司；

可见分光光度计：751型，上海分析仪器厂；

3，4－二 羟 苯 丙 氨 酸 （L－3，4－dihydroxyp henylalamine，L－DOPA）：分析纯，美国Sigma公司；

溶壁微球菌AS1.635（Micrococcus lysoleikticusAS1.635）冻干粉：生物试剂，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；

抗菌药诺氟沙星、氧氟沙星和恩诺沙星：针剂，质量分数均为99%，东北制药厂（GMP兽药认证公司）；

SOD、AST和ALT测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

其余试剂：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抗菌药物的注射 取注射用无菌诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星针剂，用无菌生理盐水稀释到3.75mg/mL。酒精棉球消毒中华绒螯蟹步足基部后，注射约0.2mL药液，使中华绒螯蟹注射量为5mg/kg体质量（为常规疾病治疗剂量）。每组注射18只中华绒螯蟹，对照组注射无菌生理盐水。

1.3.2 血清的制备 注射药液组分别于注射后6，12，24，48，72，96h随机取6只中华绒螯蟹，抽取血淋巴（在第四步足与背面交界处），在4℃下以8 000r/min离心5min，吸取上清液，－20℃冰箱保存备用。

1.3.3 酚氧化酶（PO）活力的测定 根据文献［22］修改如下：在96孔酶标板中进行反应，反应孔中加入0.2mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液（PB）170μL，10μL注射抗菌药物的待测中华绒螯蟹血清，充分混合后37℃保温15min，再加入0.6mg/mL L－DOPA 20μL，立即放入 MD VersaMax酶标仪中，振荡混匀后，每隔5min读取490nm处吸光值，反应15min；以每分钟OD490增加0.001作为1个酶活力单位（U）。对照组用生理盐水。

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1.3.4 过氧化物酶（POD）活力的测定 根据文献［23］修改如下：以邻苯二胺为底物，在96孔酶标板中加入20μL血清，再加入180μL显色缓冲液（C6H8O7·H2O 7.3g，Na2HPO4·2H2O 11.86g，双蒸水定容至1 000mL），置于酶标仪中，测490nm处的OD值（A3）；向样品中加入邻苯二胺4mg，30%H2O24μL，10mL显色缓冲液配置的显色液20μL，待摇匀后，显色15min，测490nm处的OD值（A4）。POD相对活力以APOD＝A4－A3表示。

1.3.5 碱性磷酸酶（ALP）活力的测定 根据文献［24］修改如下：取血清200μL，加入800μL pH 8.8的Tris—HCl缓冲液（加入Tris碱121.1g，浓盐酸70mL，用双蒸水定容到1 000mL），于37℃水浴10min，然后加入5mmol/L的底物50μL，反应10min，加入0.1mol/L NaOH 溶液4mL终止反应，生成的对硝基酚在400nm处测定。空白是将血清换为双蒸水。以每分钟吸光值上升0.01为一个活力单位。

1.3.6 血清溶菌酶（LSZ）活力的测定 根据文献［25］修改如下：以溶壁微球菌冻干粉为底物，溶于0.1mol/L pH 6.4的磷酸钾盐缓冲液中，调整菌悬液的OD值（OD570＝0.3），在冰浴中加入3mL菌悬液于小试管内，再加入50μL待测血清，混匀，立即在570nm下测其OD值，后将试管移入37℃水浴中反应30min，取出，迅速在冰浴中终止反应，测其OD值。溶菌活力按式（1）计算：

式中：

U——血清溶菌酶（LSZ）活力，U；

A1——待测血清反应前的OD值；

A2——待测血清反应后的OD值。

1.3.7 其他酶指标的活力测定 血清超氧化物岐化酶（SOD）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）活力的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒，按试剂盒操作说明书进行。上述测定均用751分光光度计进行读数。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2013软件处理数据和绘图，用SPSS（statiscal package for the social science）13.0对数据进行方差分析，当差异显著（P＜0.05）时，用LSD检验法进行均值间多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 喹诺酮类对酚氧化酶（PO）活力的影响

注射诺氟沙星等3种喹诺酮类抗菌药后，中华绒螯蟹体内PO活力在短期内出现上升，在6～12h达到最大值，此后逐渐减小；注射生理盐水的对照组PO活力基本稳定，后期酶活力略有下降；恩诺沙星对PO的活力增高最为明显，6h时的PO活力较对照组升高73.44%，差异极显著（P＜0.01）；96h后，PO活力下降至与对照组基本相同。上述结果初步表明，3种药物注射后可使中华绒螯蟹的PO活力得到提高，其中以恩诺沙星的影响最为明显（图1）。王海潮等［16］研究喹诺酮类抗菌药物对锯缘青蟹PO的体外试验表明，低浓度时表现为增强作用，与本试验结果一致。

图1 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清PO活力的影响Figure 1 Effects of quinolones on the PO activity of serum of Eriocheir sinensis

2.2 喹诺酮类对过氧化物酶（POD）活力的影响

由图2可知，中华绒螯蟹体内POD活力在短期内出现上升，在6～12h达到最大值，此后逐渐减小；注射盐水的对照组POD活力基本稳定，后期酶活力略有下降；POD活力在6～12h时达最大值，诺氟沙星、氧氟沙星和恩诺沙星组的POD活力分别比对照组升高34.53%，26.62%，39.18%，差异显著（P＜0.05）；96h后，POD活力下降至与对照组基本相同。3种药物注射后可使中华绒螯蟹POD活力得到提高，其中以恩诺沙星的影响最为明显。过氧化物酶是一类含辅基铁卟啉的酶类，主要作用为清除细胞生理代谢过程中的活性氧，减少其对正常细胞的损伤，提高机体的解毒免疫功能和防病抗病能力［14］，是机体解毒免疫功能和防病抗病能力的重要指标之一。本试验POD活力增加，表明喹诺酮类药物可以增强机体的免疫功能和抗病能力。

图2 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清POD活力的影响Figure 2 Effects of quinolones on the POD activity of serum of Eriocheir sinensis

2.3 喹诺酮类对碱性磷酸酶（ALP）的影响

中华绒螯蟹注射药物后，短期内ALP活力有明显升高，ALP活力在48h升至较高水平，与对照组有显著差异（P＜0.05）；随后逐渐降低，至96h时注射不同药物组ALP降至与对照相同水平，对照组酶活力未出现相应变化。结果表明：中华绒螯蟹注射药物后ALP活力升高，3种抗菌药物对中华绒螯蟹ALP的影响程度为恩诺沙星＞诺氟沙星＞氧氟沙星（图3）。碱性磷酸酶可修饰改变细菌表面结构使其更易为机体识别，加快免疫系统对异物的识别、吞噬和清除，为免疫的常规指标酶类之一。ALP活力明显升高，表明免疫系统对异物识别的结果。

图3 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清ALP活力的影响Figure 3 Effects of quinolones on the ALP activity of serum of Eriocheir sinensis

2.4 喹诺酮类对溶菌（LSZ）活力的影响

注射后，可出现血清溶菌活力升高，溶菌活力在24h时升至最大值，比对照组溶菌酶活力提高44.27%～79.56%，呈显著差异（P＜0.05），随后下降，96h降至与对照组相同水平，对照组整个试验期间溶菌水平无明显变化（图4）。表明注射药物可使中华绒螯蟹血清溶菌水平提高，以恩诺沙星最为明显，其次依次为诺氟沙星和氧氟沙星。溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，破坏和消除侵入体内的异物，在机体防御中起重要的作用［26］，是甲壳动物重要的体液非特异性免疫因子。多种免疫增强剂可增强甲壳动物溶菌酶活力，提高机体抗病能力［14］。本试验注射喹诺酮类药物后，出现血清溶菌活力升高，证实可以提高机体抗病能力。

2.5 喹诺酮类对超氧化物歧化酶（SOD）的影响

图4 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清LSZ活力的影响Figure 4 Effects of quinolones on the LSZ activity of serum of Eriocheir sinensis

注射药物后，短期内超氧化物歧化酶（SOD）活力有明显升高，SOD活力在6～12h时升至较高水平，与对照组有显著差异（P＜0.05）；随后逐渐降低，至96h时注射不同药物组的SOD降至与对照相同水平，对照组酶活力未出现相应变化。结果表明：中华绒螯蟹注射药物后促进了SOD活力的升高，恩诺沙星对中华绒螯蟹的血清SOD的影响最显著（图5）。SOD活性与生物免疫水平密切相关，可作为机体非特异性免疫力的重要评判指标［27］。多糖、灭活菌体、壳聚多糖、中药等通过注射和口服方式可显著增强河蟹的SOD活力［28］，与本试验注射药物后SOD活力升高的结果一致。

图5 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清SOD活力的影响Figure 5 Effects of quinolones on the SOD activity of serum of Eriocheir sinensis

2.6 喹诺酮类对中华绒螯蟹血清谷草转氨酶（AST）的影响

由图6可知，注射药物及生理盐水12h内，中华绒螯蟹血清AST活力均降低，24h后转趋于平稳。比较24～96h的转氨酶水平差异，发现注射药物各组的血清AST均低于对照组。血清转氨酶水平主要用于评价脏器受损情况，存在于胞内，是组织病变、中毒脏器大面积损伤的重要指标，潘鲁青等［29，30］研究重金属对凡纳滨对虾和锯缘青蟹毒性时发现，Cu2＋、Zn2＋和Cd2＋经24h作用，可使凡纳滨对虾和青蟹血清转氨酶活力升高，而肝胰腺、鳃丝和肌的酶活力随之降低，表明相关酶随组织损伤逸出脏器。本试验中血清AST均低于对照组，表明在常规使用剂量下，药物未对中华绒螯蟹产生内脏器官的明显损伤。

图6 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清AST活力的影响Figure 6 Effects of quinolones on the AST activity of serum of Eriocheir sinensis

2.7 喹诺酮类对谷丙转氨酶（ALT）的影响

由图7可知，注射药物及生理盐水12h内，中华绒螯蟹血清ALT降低趋势明显，24h后转氨酶指标趋于平稳。试验期间注射药物各组血清ALT均低于对照组。表明在常规使用剂量下，药物未对中华绒螯蟹内脏器官产生明显的损伤。本试验中药物及生理盐水注射组均出现了血清转氨酶指标急剧升高，随后降低的现象，表明转氨酶指标可随注射刺激出现较大波动，可能与注射刺激有关。

图7 喹诺酮类药物对中华绒螯蟹血清ALT活力的影响Figure 7 Effects of quinolones on the ALT activity of serum of Eriocheir sinensis

3 结论

在5mg/kg肌肉注射后，中华绒螯蟹血清PO、LSZ、POD、ALP和SOD 6～24h均有不同程度的提高，但这种促进作用不能持久，在48～96h后基本回落至与对照相同水平。对照组相关酶指标在试验过程中基本保持稳定，这种短效免疫增强作用的产生机制以及对中华绒螯蟹健康的影响，有待于今后进一步研究。本试验还发现，恩诺沙星对中华绒螯蟹血清PO、LSZ、POD、ALP和SOD等酶的影响均较诺氟沙星和氧氟沙星显著，可能与恩诺沙星代谢缓慢残留在机体时间较长有关，相关机理正在进一步研究之中。

对青蟹酚氧化酶体外试验结果表明，高浓度（500μg/mL）的喹诺酮类药物对PO有明显抑制作用，药物浓度为5～10μg/mL时（常规使用剂量），对青蟹PO无明显影响。本试验是在体外试验的基础上，以正常给药剂量（5mg/kg）用药，未出现抑制现象，表明正常用药对机体健康影响不大，低剂量给药，还可以提高中华绒螯蟹的免疫机能。

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