乙醇浸提法提取蓖麻饼粕总黄酮的工艺研究

王丽霞，陈永胜，穆莎茉莉，李国瑞，黄凤兰，罗　蕊，邢　超，孙华军，李　越，王　月

（1．内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽028000；2.内蒙古自治区高校蓖麻产业研究中心，内蒙古通辽028000；3.内蒙古民族大学生命科学院，内蒙古通辽028000）

乙醇浸提法提取蓖麻饼粕总黄酮的工艺研究

王丽霞1，2，陈永胜2，3，*，穆莎茉莉2，*，李国瑞2，3，黄凤兰2，3，罗蕊1，2，邢超2，3，孙华军2，3，李越2，3，王月3

（1．内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽028000；2.内蒙古自治区高校蓖麻产业研究中心，内蒙古通辽028000；3.内蒙古民族大学生命科学院，内蒙古通辽028000）

本文采用乙醇浸提法提取蓖麻饼粕中的黄酮类化合物，在单因素实验基础上，通过正交实验对蓖麻饼粕总黄酮的提取条件进行优化，得到乙醇浸提法提取蓖麻饼粕总黄酮的最优工艺为：乙醇浓度70%，料液比1∶25（g/mL），提取温度75℃，提取时间3h，此时总黄酮的提取率为2.50%，换算成含量为25.03mg/g。该工艺条件下总黄酮的提取率较高，连续两次浸提提取率可达总提取率的96.01%，且提取方法简单。本研究对蓖麻饼粕总黄酮工业化生产具有一定的应用价值。

蓖麻饼粕，总黄酮，提取，工艺优化

黄酮类化合物是一类以C6-C3-C6为基本碳架的天然化合物，也是多种中草药及药用植物的有效成分。大量研究表明黄酮类化合物具有多种生物活性和药理作用[1]，如抗菌[2]、消炎[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、镇痛[6]、镇咳及抑制脂肪酶活性等的作用，且对治疗冠心病、心绞痛等疾病有显著效果[7]。特别是抗自由基和抗癌、防癌[8-9]的作用使黄酮类化合物的研究进入了新的热潮，同时，黄酮类化合物的安全、无毒，促使其在化妆品、医药、食品加工等方面均具有广阔的应用前景和潜在的开发利用价值。

蓖麻是一种油料经济作物，广泛分布于世界各地，主要以蓖麻籽和蓖麻油为主要用途[10]，而蓖麻饼粕作为蓖麻籽榨油后的副产品，因其含有多种有毒物质，还未较好的开发利用，大多被当做废料遗弃，只有少数用做饲料，这就大大限制了它的开发利用价值。蓖麻叶和花中含有丰富的黄酮类化合物[11]，而关于蓖麻饼粕中黄酮类化合物的研究还尚未见报道，因此，从蓖麻饼粕中提取黄酮这种天然物质，不仅为黄酮化合物的研究开发了新的资源，而且拓宽了蓖麻综合应用途径，提高其综合利用价值，对推动蓖麻产业的发展具有积极的作用。本实验利用乙醇浸提法提取了蓖麻饼粕中的黄酮类物质，在此基础上考查了单因素对其提取率的影响，并设计正交实验进行优化，确定了提取蓖麻饼粕中总黄酮类物质的最优工艺条件，为蓖麻饼粕的开发利用提供良好的理论基础，同时也为工业化生产提供理论依据和工艺参数。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蓖麻饼粕由通辽通华蓖麻化工有限责任公司提供；芦丁标样购自中国药品生物制品检定所；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油醚（60～90℃）均为分析纯。

HH-4数显恒温水浴锅江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；AO104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；JJ-2组织匀浆捣碎机江苏省大地自动化仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1样品处理蓖麻饼粕粉碎后过60目筛，准确称取10g粉末，用滤纸包好，置于索氏提取器中，采用石油醚进行脱脂处理，按料液比1∶20（g/mL），回流温度为80℃，回流至虹吸管中溶液的颜色为无色为止，然后自然风干，密封备用[12]。

1.2.2测定波长的选择与标准曲线的绘制参考蒋新龙的方法[11]略做修改。用80%的乙醇溶液配制浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液，置于4℃冰箱避光冷藏。吸取1mL的浓度为0.2mg/mL芦丁标准溶液于10mL容量瓶中，加80%乙醇至5mL，加入5%NaNO2溶液0.5mL，摇匀放置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.5mL摇匀，再放置6min，加入4%NaOH溶液4mL，摇匀，放置10min，用紫外可见分光光度计在波长480～530nm范围内以5nm为间隔单位扫描，确定最大吸收波长。结果在510nm处有最大吸收峰，故选择510nm作为测定波长。

准确吸取浓度为0.2mg/mL芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，按上述方法显色定容，以不加黄酮提取液为空白对照，在510nm处测定其吸光度值。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标x，所测得的吸光度A为纵坐标y，绘制芦丁的标准曲线。

1.2.3蓖麻黄酮化合物的提取及含量测定准确称取样品干粉3g，加入一定量的乙醇溶液，用乙醇浸提法提取，抽滤后，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，加80%的乙醇溶解，定容到100mL容量瓶，精密吸取黄酮提取液1.0mL于10mL容量瓶中，按上述测定总黄酮类含量的方法，在波长510nm处测其吸光度值，代入回归方程，求出提取液中黄酮类化合物的含量，同时做3次平行实验，并按下式计算总黄酮提取率：

总黄酮提取率（%）＝C×V×10-3（g）/所用原料重量（g）×100

总黄酮含量（mg/g）=C×V（mg）/所用原料重量（g）

式中：C为回归方程计算所得值；V为提取液总体积（即定容的容量瓶体积100mL）。

1.2.4总黄酮提取的单因素实验采用乙醇浸提法提取蓖麻饼粕中的总黄酮，并设置单因素实验，分别考察乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间四个因素对蓖麻饼粕中的总黄酮提取率的影响。

1.2.4.1乙醇浓度对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响分别称取脱脂蓖麻饼粕粉3g，以乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液为溶剂，在料液比为1∶20，提取温度为65℃条件下提取2h，抽滤后，收集滤液，按1.2.3的方法测定。

煤炭在开采过程中，需要挖掘大量的巷道来开采作业。由于煤矿地理位置及水文等多种因素的影响，致使煤矿开采频繁发生安全事故，严重威胁到施工人员的生命安全。因此，必须采用合理的掘进支护技术。

1.2.4.2料液比对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响分别称取脱脂蓖麻饼粕粉3g，在乙醇浓度为70%，温度为65℃，料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的条件下提取2h，收集滤液，按1.2.3的方法测定。

1.2.4.3提取温度对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响分别称取脱脂蓖麻饼粕粉3g，在乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，温度为35、45、55、65、75、85℃的条件下提取2h，收集滤液，按1.2.3的方法测定。

1.2.4.4提取时间对蓖麻饼粕总黄酮提取率的影响分别称取脱脂蓖麻饼粕粉3g，在乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，温度为65℃，提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5、3h的条件下进行处理，收集滤液，按1.2.3的方法测定，比较不同时间对蓖麻饼粕总黄酮提取率的影响。

1.2.5总黄酮提取的正交实验为了获得蓖麻饼粕总黄酮的最佳提取工艺条件，本实验在单因素实验的基础上，将乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个因素进行正交实验设计，选用4因素3水平来进一步确定总黄酮的最佳提取工艺条件。正交实验因素与水平见表1。

表1　L9（34）因素水平表Table.1　Factors and levels of the test L9（34）

1.2.6数据处理采用SPSS13.0软件，对数据进行处理与分析。

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制

图1　芦丁标准曲线Fig.1　The standard curve of rutin

2.2单因素实验

2.2.1乙醇浓度对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响

由图2可以看出，随着乙醇浓度的增加，蓖麻饼粕总黄酮的提取率也逐渐增大，当乙醇浓度达到70%时，蓖麻饼粕中的总黄酮提取率达到最大值，此后再增加乙醇浓度，总黄酮的提取率反而下降。这可能是由于随着乙醇浓度的增大，叶绿素、亲脂性强的成分和其他的一些醇溶性杂质等的浸出量也增加，而这些物质的存在会影响黄酮类化合物检测，从而导致黄酮化合物提取率的下降，并且随着乙醇浓度的增加，生产成本在增加，而杂质浸出量的增加又会给后续操作带来不便，因此确定70%为提取蓖麻饼粕总黄酮的最佳乙醇浓度。

图2　乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.2　Influence of alcohol concentration on extraction ratio of the total flavonoids

2.2.2料液比对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响由图3可看出，随着料液比的增大，蓖麻饼粕总黄酮的提取率亦增大，当料液比达到1∶20时，溶质中的有效成分已基本溶出，再增加料液比，蓖麻饼粕中总黄酮的提取率增加缓慢，可见，在一定范围内，溶剂用量增加使单位体积的溶剂中溶质的浓度降低，这有利于溶质的扩散，从而促进黄酮类化合物的浸出，溶剂用量少，提取不太完全，但当溶剂量再增大时，固液接触饱和[13]，不能明显提高总黄酮提取率，且过量的浸提溶剂反而会造成一定的经济浪费，并为后续的浓缩等操作带来不必要的麻烦。综合考虑浸提效果和经济及后续处理的复杂性等方面的因素，用量不宜过大，故将最佳料液比定为1∶20较合适。

图3　料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3　Influence of solid-liquid ratio on extraction ratio of the total flavonoids

2.2.3提取温度对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响

从图4中可以看出，随着提取温度的升高蓖麻饼粕中的总黄酮类化合物的提取率也逐渐增大，这是因为随着温度升高，分子运动速度加快，渗透、溶解和扩散作用增强，从而促进黄酮类化合物的溶出。而当温度增加到85℃时蓖麻饼粕总黄酮的提取率反而下降，这可能是由于，一方面，温度过高，杂质的溶出量增加，部分热不稳定的黄酮类化合物分解所致；另一方面，温度超过了乙醇的沸点78℃，导致乙醇挥发损失，从而降低了提取率。故本实验选75℃为提取蓖麻饼粕总黄酮的最佳提取温度。

图4　提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4　Influence of extracting temperature on extraction ratio of the total flavonoids

2.2.4提取时间对蓖麻饼粕总黄酮提取率的影响由图5可以看出，在一定的时间段内，蓖麻饼粕中总黄酮的提取率随时间的增加而快速增加，但随着时间的再延长，总黄酮提取率增长幅度不大，这就表明总黄酮的提取已基本完全。由此可见，不同提取时间对总黄酮提取率的影响很大，时间过短，总黄酮未能充分浸出，时间过长不利于生产周期，增加生产成本和消耗，还可能导致黄酮类化合物的热分解损失，或杂质溶出，影响黄酮的测定。综上分析选择2.5h为最佳提取时间。

2.3正交实验

考虑到各因素之间的交互作用，本实验以蓖麻饼粕总黄酮提取率为评价指标，在上述单因素实验结果的基础上设计正交实验，选用4因素3水平的正交方法进一步考察了乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间对蓖麻饼粕总黄酮提取率的影响，以确定最佳提取工艺，实验结果分析见表2。

图5　提取时间对蓖麻饼粕总黄酮提取率的影响Fig.5　Influence of extracting time on extraction ratio of the total flavonoids

表2　L9（34）正交实验结果Table.2　Results of the orthogonal test L9（34）

由表2可知，各因素及其水平对蓖麻饼粕中总黄酮提取率的影响表现出一定的差异性。4个影响因素的主次顺序为C＞A＞B＞D，即浸提温度对提取率的影响最大，其次是乙醇浓度、料液比，而提取时间的影响最小。由实验结果可以看出最佳提取工艺条件为A2B3C3D3，即乙醇浓度70%，料液比1∶25（g/mL），提取温度75℃，提取时间3h。

2.4验证实验

在乙醇浓度70%，料液比1∶25（g/mL），提取温度75℃，提取时间3h的条件下进行3次平行实验，得蓖麻饼粕总黄酮的平均提取率为2.50%，换算成蓖麻饼粕黄酮含量为25.03mg/g，比正交表中的值高，故可确定此条件为最优工艺条件。

为了考察最佳工艺的提取效果，在正交实验的最优条件下，提取5次，分别计算蓖麻饼粕总黄酮的提取率，结果如表3，通过连续5次提取，蓖麻饼粕中黄酮含量接近零，而连续两次提取总黄酮的提取率已可达总提取率的96.01%，可见该工艺较好。

表3　总黄酮提取率随提取次数的变化Table.3　The extraction rate of total flavonoids varies with the extraction times

3　结论与讨论

通过实验得出，提取蓖麻饼粕总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比1∶25（g/mL）、提取温度75℃、提取时间3h，此时总黄酮的提取率为2.50%，换算成蓖麻饼粕黄酮含量为25.03mg/g，高于蓖麻叶（20.411mg/g）和花（18.655mg/g）中总黄酮的含量[11]，同时也高于同等方法下绿豆芽（6.8mg/g）[13]、豆粕（5.41mg/g）[14]、花生粕（1.6mg/g）[15]、绿豆皮（3.879mg/g）[16]等的总黄酮含量，可见蓖麻饼粕中含有丰富的黄酮类化合物，是一种较好的获取黄酮的新资源，有很高的开发利用价值，值得深入研究。

在最优工艺条件下多次提取，乙醇浸提法的单次总黄酮提取率可达总提取率的84.68%，连续提取2次，总黄酮的提取率可达总提取率的96.01%。该法与超声波法、微波法相比虽然耗时较长，但总黄酮提取率较高，对设备要求不高，操作简单，工艺易于控制，且以乙醇为提取剂，具有成本低，对环境及人类无毒害等优点。本研究为工业化提取蓖麻饼粕总黄酮提供了新的线索，为后续进一步研究开发蓖麻饼粕中的总黄酮提供了实验依据，也为蓖麻饼粕的综合利用开辟了新的途径，更为今后蓖麻饼粕总黄酮在食品、医药方面的进一步研究奠定了基础。

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Study on the extraction of the total flavonoids from castor bean meal by ethanol extraction technology

WANG Li-xia1，2，CHEN Yong-sheng2，3，*，MU Sha-moli2，*，LI Guo-rui2，3，HUANG Feng-lan2，3，LUO Rui1，2，XING Chao2，3，SUN Hua-jun2，3，LI Yue2，3，WANG Yue3
（1.College of Agriculture，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China；2.Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor，Tongliao 028000，China；3.College of Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China）

The flavonoids from the castor bean meal were extracted by ethanol extraction technology.On the basis of single factor experiment，through the orthogonal test，the extraction conditions of total flavonoids from castor bean meal were optimized.The best optimal technological conditions for extraction of total flavonoids from castor were as follows：ethanol concentration was 70%，the ratio of solid to liquid was 1∶25（g/mL），extracting temperature was 75℃and extracting duration was 3h，then the extraction ratio of total flavonoids was 2.50%，converted to the content of 25.03mg/g.Under this condition，the extraction rate of flavonoids was higher，two consecutive extraction ratio could reach 96.01%.The extraction method was simple，which had a certain application value for industrialized production of total flavonoids of castor bean meal.

castor bean meal；total flavonoids；extraction；process optimization

TS201.1

B

1002-0306（2015）04-0282-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.053

2014－09-24

王丽霞（1990-），女，在读硕士研究生，主要从事蓖麻功能性成分方面的研究。

陈永胜（1971-），男，教授，研究方向：生物技术。

穆莎茉莉（1979-），女，讲师，研究方向：蓖麻饼粕功能性成分研究。

国家自然科学基金（31060194）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY14188）。