共轭亚油酸和α-亚麻酸对HepG2细胞核转录因子NF-E2相关因子及谷胱甘肽硫转移酶A1表达的影响

李广亮 张秀英 齐 悦 郝丽红 张金铭

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

共轭亚油酸(CLA)和α-亚麻酸(ALA)分别是多不饱和脂肪酸(PUFA)中n-6家族和n-3家族的重要代表，是人和动物不可或缺的营养物质，在食品和饲料中保持适量的CLA和ALA能够有效预防和抑制代谢综合征及其引发的多种疾病［1-3］。核转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)是可诱导多种解毒酶、生物转化酶和异生物质转运蛋白的关键核转录因子［4-5］，谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是Nrf2信号通路下游的靶基因，其中谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)是Ⅱ相代谢酶GSTs酶系重要亚型，占胞液总GSTs的65% ～75%，是细胞防御系统重要的组成部分。因此研究CLA和ALA与Nrf2和GSTA1的相关性具有重要意义［6］。研究证明，Nrf2具有抗氧化和抗炎症等功能，被认为是能够治疗多种代谢综合征引起的疾病的潜在药物作用靶点［7］，而在鸡和家兔的饲料中添加2种脂肪酸均发现会提高鸡蛋和家兔肝脏中Nrf2的表达量［8-9］。但对于不同浓度的 CLA和 ALA作用HepG2细胞时，对Nrf2-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)信号通路以及GSTA1表达量的影响，鲜有详细报道。鉴于此，本文旨在探讨CLA和ALA以不同的浓度作用HepG2细胞24 h时，对HepG2细胞中Nrf2和GSTA1的mRNA以及蛋白质表达量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

HepG2细胞由哈尔滨医科大学药理学实验室赠送;DMEM培养基购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司;CLA和ALA购自Sigma公司;RT-PCR试剂盒购自全式金生物技术有限公司;Trizol购自Invitrogen公司;人源细胞Nrf2抗体购自Immunoway公司;GSTA1抗体购自武汉三鹰公司;辣根过氧化物标记羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和RIPA裂解液均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养和试验设计

HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于25 mL培养瓶，5%CO2、37℃条件下培养。使用0.25%的胰蛋白酶消化，将对数生长期细胞接种于六孔板，待细胞生长稳定、细胞融合率达到80%以上时，将皂化后的CLA和ALA加入培养基至所需浓度。分别添加0.2、0.5和1.0 mmol/L CLA，0.2、0.5 和 1.0 mmol/L ALA，作用24 h，每个处理6个重复，并设空白对照组。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)试验

将细胞接种于96孔板，待其长成单层后弃掉原有培养液，加入稀释后的CLA和ALA培养液，浓度梯度分别是 0、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0 和5.0 mmol/L。每梯度平行接种12个孔，同时设对照孔。每孔加入100μL培养基，培养24 h，加入10μL的MTT，培养4 h，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解紫色结晶，酶标仪检测，计算细胞成活率。

细胞成活率(%)=100×样品孔吸光度值/对照孔吸光度值。

1.2.3 总 RNA提取和 RT-PCR检测 Nrf2和GSTA1的mRNA表达量

用TRIzol(Invitrogen)法提取HepG2细胞中总RNA，立刻使用反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司)反转录成cDNA。使用荧光定量PCR仪(ABI 7500 RT-PCR SDS system)定量。通过SYBR Green荧光定量染料法，反应条件设置为94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火34 s，循环次数40次。使用引物如下，Nrf2的上游引物:5’-TTCCCGGTCACATCGAGAG-3’，下游引物:5’-TCCTGTTGCATACCGTCTAAATC-3’;GSTA1的上游引物:5’-GGGAAAGACATA AAGGAGAGAG-3’，下游引物:5’-TCAAAGGCAGGGAAGTAGC-3’;β -肌动蛋白(β-actin)的上游引物:5’-GATCCACATCAGCTGGGAAGG-3’，下游引物:5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’。

1.2.4 蛋白质的提取以及蛋白质印迹法(Western blotting)检测Nrf2和GSTA1的蛋白质表达量

采用RIPA裂解法，提取细胞总蛋白。将弃掉培养液的细胞，用灭菌处理的冰PBS冲洗1～2次，加入80μL RIPA裂解液(碧云天试剂公司)用细胞刮刀刮取细胞，并吸取进离心管中，14 000×g离心30 min，吸取上层清液备用，以上提取蛋白质操作都在冰上操作，以防止在提取过程中蛋白质降解，通过紫外分光光度法和BCA法测定蛋白质浓度。将蛋白质样品稀释至相同且合适的浓度进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)电泳(电泳时间:100 V、2 h;100 V、40 min)。湿转至硝酸纤维素(NC)膜(转膜时间:100 V、2 h)，用三乙醇胺缓冲盐(TBST)溶液稀释的终浓度为5%的脱脂乳封闭1 h，用兔抗人Nrf2抗体(1∶1 000)孵育4℃过夜。然后用羊抗兔二抗室温封闭1 h，采用电化学发光检测法(ECL法)显色。同一样本用β-actin作为内参。结果用Image J凝胶分析软件进行吸光度值分析。每个结果至少经过3次重复试验得到。

1.3 数据分析

试验数据用平均值±标准差表示，用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 不同浓度的 CLA和 ALA对 Hep G2细胞成活率的影响

由表1可知，不同浓度的CLA和 ALA对HepG2细胞成活率的影响，与对照组相比，CLA和ALA低浓度时对细胞成活率无显著影响(P＞0.05)，当 CLA 和 ALA 的 浓 度 为 3.0 和5.0 mmol/L时，极显著降低HepG2细胞的成活率(P＜0.01)。本试验所使用的浓度对细胞成活率没有显著影响(P＞0.05)。

表1 不同浓度的CLA和ALA对HepG2细胞成活率的影响Table 1 Effects of different CLA and ALA concentrations on survival percentage of HepG2 cells %

2.2 不同浓度的 CLA和 ALA对 Nrf2 mRNA表达量的影响

由图1可知，与对照组相比，CLA浓度为0.2和0.5 mmol/L时，Nrf2 mRNA的表达量分别提高4.53倍和3.39倍，差异极显著(P ＜0.01);CLA浓度为1.0 mmol/L时，Nrf2 mRNA的表达量与对照组相比提高1.67倍，差异显著(P＜0.05)。与对照组相比，ALA浓度为0.2 mmol/L时，Nrf2 mRNA表达量变化不显著(P＞0.05);ALA浓度为0.5和1.0 mmol/L时，Nrf2 mRNA表达量分别提高2.65 倍和8.44 倍，差异极显著(P ＜0.01)。

2.3 不同浓度的CLA和ALA对GSTA1 mRNA表达量的影响

由图2可知，与对照组相比，CLA浓度为0.5和1.0 mmol/L时，GSTA1 mRNA表达量分别提高4.39倍和 3.35 倍，差异极显著(P ＜0.01);CLA浓度为0.2 mmol/L时，GSTA1 mRNA表达量与对照组相比提高1.61倍，差异显著(P＜0.05)。与对照组相比，ALA浓度为0.2 mmol/L时，GSTA1 mRNA变化不显著(P ＞0.05)，ALA 浓度为 0.5和1.0 mmol/L时，GSTA1 mRNA表达量分别提高3.00倍和 4.59 倍，差异极显著(P ＜0.01)。

2.4 不同浓度的CLA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响

由图3可知，与对照组相比，CLA浓度为0.2和0.5 mmol/L时，Nrf2蛋白质表达量提高1.85倍和1.91倍，差异极显著(P＜0.01);CLA 浓度为1.0 mmol/L时，Nrf2蛋白质表达量提高 1.27倍，差异不显著(P＞0.05)。与对照组相比，CLA浓度为 0.2和0.5 mmol/L时，GSTA1蛋白质表达量分别提高1.93倍和2.05倍，差异极显著(P＜0.01);CLA 浓度为 1.0 mmol/L 时，GSTA1 蛋白质表达量提高1.53倍，差异显著(P＜0.05)。

图1 不同浓度的CLA和ALA对Nrf2 mRNA表达量的影响Fig.1 Effects of different CLA and ALA concentrations on expression of Nrf2 mRNA

2.5 不同浓度的ALA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响

由图4可知，与对照组相比，ALA浓度为0.2 mmol/L时，Nrf2蛋白质表达量提高1.35倍，差异显著(P＜0.05);ALA浓度为 0.5和1.0 mmol/L时，Nrf2蛋白质表达量分别提高1.77倍和1.94倍，差异极显著(P＜0.01)。与对照组相比，当 ALA 浓度分别为0.2、0.5 和1.0 mmol/L时，GSTA1蛋白质表达量分别提高了1.75倍、2.28倍和 2.86 倍，差异极显著(P ＜0.01)。

图2 不同浓度CLA和ALA对GSTA1 mRNA表达量的影响Fig.2 Effects of different CLA and ALA concentrations on expression of GSTA1 mRNA

图3 不同浓度的CLA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响Fig.3 Effects of different CLA concentrations on protein expression of Nrf2 and GSTA1

3 讨论

基因和环境因素是影响人和动物的健康和疾病的关键因素，营养物质是环境因素中重要的组成部分，而且其变化会影响人和动物的健康和疾病［10-11］。CLA和ALA是机体所必需的重要营养物质，2种不饱和脂肪酸对于维持人和动物的健康具有重要作用。目前，对于CLA和ALA的研究，大多数是进行体内试验，研究集中在摄入食物时的比例和血液中的含量等方面，而在细胞水平上，CLA和ALA对细胞状态的影响和对细胞内关键信号通路的影响鲜有研究［1，9，12］。

图4 不同浓度的ALA对Nrf2和GSTA1蛋白质表达量的影响Fig.4 Effects of different ALA concentrations on protein expression of Nrf2 and GSTA1

GSTA1具有降解多种有毒化学物质和调节体内氧化平衡的作用，也是Nrf2-Keap1信号通路调控的下游靶基因之一［6］，Nrf2是信号通路的关键核转录因子，提高Nrf2的表达量对于机体具有保护作用，可治疗和预防人和动物的代谢综合征和脂肪肝等多种疾病，适量的摄入CLA和ALA，对于保证人和动物的健康至关重要［12，14］。本试验结果表明，不同浓度的CLA和ALA均不同程度上提高了Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质的表达量，但提高的量不同。Selene 等报道［14］，0.4 mmol/L ALA可通过提高HepG2细胞中Nrf2 mRNA和蛋白质表达量，由此减轻砷引起的细胞损害;还有研究证明，在饲料中添加ALA可增加家兔脑内Nrf2的蛋白质表达量，调节脑内的氧化还原状态，缓解脑退行性变等多种脑内疾病［15］;并且在威斯塔鼠饲料中添加CLA，同样会增加Nrf2蛋白质的表达量［11］，这与本试验结果可相互印证。在本试验选择的浓度范围内，ALA的浓度越大，Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质表达量提高的越多;而CLA则是在浓度为0.5 mmol/L时，诱导 Nrf2和 GSTA1的mRNA和蛋白质表达的作用最强，而CLA浓度为1.0 mmol/L时，提高 Nrf2和 GSTA1的 mRNA和蛋白质的表达量相对减少。ALA和CLA都能增强Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白质表达量，而不同的浓度增强的幅度变化较大。CLA和ALA作为必需脂肪酸，摄入的多少对于机体的健康非常重要。CLA和ALA在体内含量不同时，引起相应的生物学特征改变的具体机制仍需进一步研究。

4 结论

CLA在较低浓度时，诱导 Nrf2和 GSTA1 mRNA和蛋白质表达量作用较强，而随ALA浓度增加Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白质的表达量逐渐增多。

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