菌落原位杂交技术在环境微生物检测中的应用

丁海燕，冯 伟，李凌智，黄永红，张 虹 (大庆师范学院生物工程学院，黑龙江大庆 163712)

菌落原位杂交技术在环境微生物检测中的应用

丁海燕，冯 伟，李凌智，黄永红，张 虹 (大庆师范学院生物工程学院，黑龙江大庆 163712)

微生物技术在处理环境污染物等方面具有成本低、无二次污染、反应条件温和等优点。为从根本上解决环境问题，就环境中微生物的检测为主题，介绍了菌落原位杂交的原理以及在环境微生物检测中的应用。

菌落原位杂交；环境微生物；检测

20世纪70年代，Pardue 等[1]和 John等[2]成功开发了原位杂交技术，他们利用放射性同位素标记的 DNA 作探针与爪蟾卵细胞制片杂交，通过显微放射自显影检测杂交信号，检测出细胞与探针互补核酸序列。这是最初的原位杂交技术，开创了采用分子生物学技术研究细胞遗传学的历史。此后，随着该项技术的进一步发展，原位杂交技术很快成为医学、遗传学、环境微生物学的重要技术[3]。

根据标记物的不同，探针可分为同位素标记探针和非同位素标记探针。常用的同位素有32P、35S、3H、125I。同位素标记探针具有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但其缺点是具有放射性，对人和环境有伤害。非同位素标记探针近年应用较广泛，常用的非同位素标记物有荧光素、生物素、地高辛。按照核酸性质的不同，又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、寡核苷酸探针。随着原位杂交技术的发展，原位杂交又逐渐细化为菌落原位杂交和组织原位杂交。笔者介绍了菌落原位杂交的原理以及在环境微生物检测中的应用。

1 菌落原位杂交基本原理

菌落原位杂交的过程是将琼脂平板中培养的细菌转置于硝酸纤维素滤膜上，然后使培养的菌落裂解释放出其中的DNA，烘干DNA固定在膜上，和标记的探针杂交，用放射自显影或荧光显微镜等方法检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

组织原位杂交通常简称为原位杂交，主要是指组织或细胞层次的原位杂交。菌落原位杂交与组织原位杂交的不同是：菌落原位杂交需要裂解细菌释放出DNA，与标记探针进行杂交；组织原位杂交是通过酶解等方法改变组织细胞的透过性，让探针能够进入组织细胞内与待检测核酸序列杂交[4]。

目前，原位杂交技术多种多样，如荧光原位杂交技术、基因组原位杂交技术等。但对于环境中存在的微生物进行测试时，菌落原位杂交仍是最常用的方法。

2 菌落原位杂交在环境微生物多样性诊断中的应用

长期以来，纯培养一直是研究环境微生物的主要方法，由于环境微生物中能被培养出来的只有很小一部分，只有 非常少的微生物能被分离和鉴定，所以进行微生物多样性分析时，其结果通常是有局限性的。在不同环境微生物研究时发现，高达99%以上的微生物不能通过常规方法培养[5]，由于核酸序列能够提供遗传距离、分子杂交探针等信息，可用于自然生态系统中微生物的鉴定[6]。环境微生物与菌落原位杂交技术的结合，对于环境微生物组成、结构与功能的研究有极大帮助，尤其是具有特殊分层结构，多样化代谢菌群共存与协同偶合等特性的颗粒污泥，对于深层次了解环境微生物群落结构、种群的关系和处理效率的相关性，进一步提高废水处理效率具有极重要的理论和实用意义。利用菌落原位杂交技术研究自然环境微生物群落结构的报道很多，如海水沉积物[7]的群落，高山湖雪水[8]的浮游菌体，海水[9]和河水[10]的群落特征，土壤[11]和根系表面[12]的寄居群落。此外，新的种属或一些未被培养的种属鉴定，菌落原位杂交技术发挥了重要作用。菌落原位杂交技术[13-14]在探索菌群的生态学成分，以及外界条件对群落的动态影响方面均是非常有力的技术手段。

3 菌落原位杂交在污水微生物检测中的应用

1914年，Ardern 和 Lockett发明了活性污泥污水处理方法。人们通过检测特异底物的转化率，如耗氧速率、磷吸收和释放、硝化、反硝化、Fe3+的还原等方法，研究活性污泥中重要功能菌群的活性[15]。而菌落原位杂交技术的应用可以完整地展现出菌落的空间排列顺序，数量的多少等一系列信息，所以利用菌落原位杂交和放射自显影技术研究废水处理系统中微生物的数目、活性和对特异底物的消耗，效果显著。

3.1 硝化细菌微生物中硝化细菌和氨氧化菌的数目与空间分布严格限制硝化和反硝化过程所处的阶段，因此在调控废水脱氮的运行工艺中，生物处理系统中硝化细菌和氨氧化菌的研究极为重要。硝化细菌是一类化能自氧菌，传统的研究方法耗时长，要经过富集、分离、分类和鉴定等步骤，又因所用的培养基有选择性，使某些易于培养的菌株，如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacter winogradskyi等超过了其他硝化细菌，这样得到的优势类群与样品真实情况有明显差异。菌落原位杂交技术的引入解决了上述难题。通过人工设计合成的硝化细菌和氨氧化菌探针，对污水污泥中硝化细菌的多样性采用菌落原位杂交法进行了跟踪分析，发现许多具有优势的硝化菌加以培养后，真正实现了工业污水、废水的硝化处理。

3.2 除磷细菌除磷脱氮工艺在废水处理工程中已被广泛应用，特别是强化除磷(EBPR)工艺，对污水的除磷效果尤为显著。国内外研究者对不同除磷工艺中聚磷菌的生态变化进行了分子杂交分析。菌落原位杂交技术的应用克服了除磷菌难以用常规方法培养的困难，对生物除磷工艺的改进起到了指导性作用。

3.3 难降解有机物功能降解菌近年来，大量学者将原位分子杂交技术应用于功能降解菌的生态变化研究中，克服了功能降解菌用常规方法培养的困难，真正开创了一个有效利用生物降解的绿色时代。

4 小结

尽管菌落原位杂交技术应用于环境微生物群落分子生态研究中还存在一些问题，如同位素的放射性对人体的伤害，试验周期较长等，但因其高度的灵敏性和准确性，仍受到许多科研人员的欢迎，并广泛应用于微生物检测、菌落定位等研究领域。环境微生物学的研究可以从菌落原位杂交技术中得到大量信息，且随着技术的不断进步，菌落原位杂交的准确性和灵敏度将进一步提高，必将在环境微生物群落结构研究领域得到更加充分的应用，对工业废水的污染控制作出贡献

[1] PARDUE M L，GALL J G.Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological peparations [J].Proc Natl Acad Sci USA，1969，64：600-604.

[2] JOHN H，BIRNSTILEL M，JONES K.RNA：DNA hybrids at the cytogenetical level[J].Nature，1969，223：582-587.

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[13] 陈书琨，沈正达，胡永浩，等.一种改良的快速筛选重组DNA 噬菌体噬斑的原位杂交技术[J].生理化学与生物物理进展，1992，19(5)：382-384.

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Application of Colony in situ Hybridization in Detection of Environmental Microorganisms

DING Hai-yan, FENG Wei, LI Ling-zhi et al

(School of Biological Engineering, Daqing Normal University, Daqing, Heilongjiang 163712)

Microbial technology in the treatment of environmental pollutants has the advantages of low cost, no two pollution, mild reaction conditions etc. In order to fundamentally solve the environmental problems, this paper introduces the principle of colony in situ hybridization and its application in the environmental detection of microorganism.

Colony in situ hybridization; Environmental microorganism; Detection

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12513004)；大庆师范学院科学研究基金项目(12ZR04)。

丁海燕(1973- )，女，黑龙江大庆人，副教授，从事生物技术研究。

2015-03-27

S 188；X 172

A

0517-6611(2015)14-025-02