神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PDK1、GSK3β蛋白表达的影响

李晓艳，周 农

神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PDK1、GSK3β蛋白表达的影响

李晓艳1，2，周 农1

目的观察单唾液酸神经节苷脂（GM1）联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区PDK1、GSK3β蛋白表达的影响，探讨其可能的作用方法随机将大鼠分为假手术组、模型组、GM1组（剂量20 mg／kg，腹腔注射，1次／d）、依达拉奉组（剂量3 mg／kg，腹腔注射，2次／d）、GM1联合依达拉奉组，采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，分别对缺血2 h后再灌注3、7、14 d，采用免疫组化Envision两步法检测大鼠模型缺血半暗带PDK1、GSK3β蛋白表达的阳性细胞平均吸收光密度和阳性面积单位结果在缺血半暗带，再灌注3、7、14 d各时间点，GM1联合依达拉奉组PDK1蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位分别显著高于GM1组、依达拉奉组（P＜0．05）、模型组（P＜0．01），GSK3β蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位分别显著低于GM1组、依达拉奉组（P＜0．01）、模型组（P＜0．01）结论GM1联合依达拉奉能增强缺血半暗带PDK1蛋白表达，抑制GSK3β蛋白表达。

单唾液酸神经节苷脂；依达拉奉；脑缺血；3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1；糖原合成酶激酶-3β；凋亡

脑血管疾病以高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率的特点，成为当前疾病3大死亡原因之一。而细胞凋亡是脑缺血中最重要的病理生理机制之一，其主要发生在病灶周围的半暗带区，抑制脑缺血后细胞凋亡也成为抗缺血治疗的重要手段。研究［1］表明单涎酸神经节苷脂（monosialoganglioside，GM1）能通过清除氧自由基、改善细胞内钙超载而起到抗神经细胞凋亡的作用。依达拉奉是一种自由基清除剂，可有效提高大鼠局灶性脑缺血时脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低丙二醛（MDA）水平，并且有效抑制caspase-3表达，对抗神经细胞凋亡［2］。近年来，PI3K／Akt信号通路在脑缺血神经元凋亡的调节作用备受关注［3］，而3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）通过磷酸化Akt使其活性增强；糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthasekinase-3β，GSK3β）是PI3K／Akt通路下游分子，可以通过Bcl-2家族来诱导凋亡［4］。该实验采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，观察GM1联合依达拉奉对模型大鼠缺血半暗带PDK1、GSK3β蛋白表达的影响，探讨其对脑缺血神经细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1．1 动物分组 健康SD大鼠105只，南京医科大学实验动物中心提供，雌雄各半，月龄4个月，280～320 g，随机分为假手术组、模型组、GM1组、依达拉奉组、GM1联合依达拉奉组，每组21只，缺血2 h后，再分别分为再灌注3、7、14 d 3个亚组。

1．2 局灶性脑缺血再灌注模型复制 采用线栓法阻塞大鼠左侧大脑中动脉，制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，缺血2 h后，分别再灌注3、7、14 d，假手术组仅作血管分离，具体方法参照文献［5］。

1．3 药物与试剂GM1由山东齐鲁制药有限公司提供（规格：20 mg／2 ml，批号：4010081），依达拉奉注射液由吉林博大制药有限责任公司提供（规格：30 mg／20 ml，批号：01-140112）。PDK1、GSK3β一抗购自美国Santa Cruz公司，DAB显色试剂盒、Envision两步法试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．4 给药剂量与方法依达拉奉注射液，剂量3 mg／kg，应用生理盐水稀释成浓度1 mg／ml，腹腔注射，2次／d；GM1，剂量20 mg／kg，用生理盐水稀释成浓度1 mg／ml，腹腔注射，1次／d。假手术组、模型组用等量0．9%生理盐水腹腔注射。

1．5 取材分别于再灌注的3、7、14 d，10%水合氯醛麻醉（3．6 ml／kg体重，ip）大鼠，打开胸腔，于右心耳部剪一小口，从左心室插入导管至主动脉，向内快速注入37℃肝素化NS 250 ml，至右心耳流出液变清亮，然后注入40 g／L多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 ml，灌流固定30 min后断头取脑，除去小脑和脑干，取大脑，放入40 g／L多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定1周，脱水、透明、浸蜡，在视交叉前后连续制作脑部冠状切片。

1．6 免疫组化两步法检测采用Envision两步法进行免疫组化染色，DAB显色液显色，PDK1、GSK3β一抗稀释浓度为（1∶150），阴性对照采用正常山羊血清替代一抗进行，苏木精轻度复染。

根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法［6］，大脑中动脉阻塞的同侧额顶叶皮质上部界定为半暗带的等值观察区，采用南京捷达JD-801图像分析系统，在相同视野下（×400），分别对相邻切片的PDK1、GSK3β蛋白免疫反应阳性细胞的平均吸收光密度和阳性面积单位进行分析。

1．7 统计学处理采用SPSS 16．0统计软件分析，所有计量资料数据用±s表示，每组实验所得数据采用方差分析，两组间比较用t检验，多组间比较采用方差分析。

2 结果

2．1 GM1联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PDK1蛋白表达的影响阴性对照未见PDK1蛋白表达，假手术组缺血半暗带PDK1蛋白见少量表达，脑缺血2 h后再灌注的各时间点，模型组PDK1蛋白表达明显增强，主要表达于半暗带神经细胞胞质，其阳性面积单位和平均吸收光密度值显著高于假手术组（P＜0．01）；再灌注各时间点，GM1联合依达拉奉组PDK1蛋白表达明显增强，其阳性面积单位和平均吸收光密度值显著高于模型组（P＜0．01）；再灌注各时间点，GM1组、依达拉奉组PDK1蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著高于模型组（P＜0．01）；再灌注各时间点，GM1联合依达拉奉组PDK1蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著高于GM1组、依达拉奉组（P＜0．05）。其中，关于PDK1的阳性单位面积GM1联合依达拉奉组与GM1组比较，F3d＝1．504，F7d＝2．527，F14d＝1．495；GM1联合依达拉奉组与依达拉奉组比较，F3d＝0．086，F7d＝0．800，F14d＝0．256；平均吸收光密度值GM1联合依达拉奉组与GM1组比较，F3d＝0．600，F7d＝2．705，F14d＝0．100；GM1联合依达拉奉组与依达拉奉组比较，F3d＝1．772，F7d＝3．250，F14d＝1．338。见表1、图1。

2．2 GM1联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠GSK3β蛋白表达的影响阴性对照未见GSK3β蛋白表达，假手术组缺血半暗带GSK3β蛋白见少量表达，脑缺血2 h后再灌注的各时间点，模型组GSK3β蛋白表达明显增强，主要表达于半暗带神经细胞胞质，其阳性面积单位和平均吸收光密度值显著高于假手术组（P＜0．01）；再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组GSK3β蛋白表达明显减弱，其阳性面积单位和平均吸收光密度值显著低于模型组（P＜0．01）；再灌注各时间点，GM1组、依达拉奉组GSK3β蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著低于模型组（P＜0．05）；再灌注各时间点，GM1联合依达拉奉组GSK3β蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著低于GM1组、依达拉奉组（P＜0．01）。其中，关于GSK3β的阳性单位面积GM1联合依达拉奉组与GM1组比较，F3d＝0．495，F7d＝1．422，F14d＝0．588；GM1联合依达拉奉组与依达拉奉组比较，F3d＝0．708，F7d＝9．81，F14d＝ 2．885；平均吸收光密度值GM1联合依达拉奉组与GM1组比较，F3d＝0．014，F7d＝0．09，F14d＝0．816；GM1联合依达拉奉组与依达拉奉组比较，F3d＝0．108，F7d＝3．642，F14d＝1．026。见表2、图2。

表1 各组缺血2 h再灌注不同时间缺血半暗带PDK1蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积和平均吸收光密度值（n＝7，±s）

与假手术组比较：**P＜0．01；与模型组比较：＃＃P＜0．01；与依达拉奉组比较：▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；与GM1组比较：△P＜0．05，△△P＜0．01

组别阳性单位面积（×102）平均吸收光密度值3 d7 d14 d 3 d7 d14 d假手术12．21±1．0212．22±0．9012．35±1．460．115±0．0090．122±0．0090．118±0．011模型16．72±0．82**18．28±0．47**17．81±0．84**0．154±0．006**0．172±0．009**0．171±0．009**依达拉奉20．95±0．82＃＃23．60±0．77＃＃22．21±0．57＃＃0．202±0．012＃＃0．226±0．005＃＃0．225±0．008＃＃GM10．98±1．49＃＃22．81±0．94＃＃21．81±1．23＃＃0．206±0．010＃＃0．221±0．016＃＃0．222±0．013＃＃依达拉奉＋GM123．10±0．71＃＃▲▲△△25．50±0．67＃＃▲▲△△23．38±0．78＃＃▲▲△0．229±0．008＃＃▲▲△△0．243±0．011＃＃▲▲△△0．242±0．017＃＃▲△

表2 各组缺血2 h再灌注不同时间缺血半暗带GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积和平均吸收光密度值（n＝7，±s）

与假手术组比较：**P＜0．01；与模型组比较：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01；与依达拉奉组比较：▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；与GM1组比较：△P＜0．05，△△P＜0．01

组别阳性单位面积（×102）平均吸收光密度值3 d7 d14 d 3 d7 d14 d假手术9．93±0．609．88±0．699．82±0．610．098±0．0100．091±0．0100．095±0．009模型17．86±0．57**21．50±0．83**21．32±1．32**0．198±0．010**0．217±0．010**0．214±0．008**依达拉奉15．96±0．57＃＃20．23±0．75＃19．05±0．94＃＃0．166±0．011＃＃0．204±0．004＃0．193±0．011＃＃GM116．31±0．88＃＃20．74±0．5619．89±0．68＃0．170±0．009＃＃0．207±0．0080．202±0．006＃＃依达拉奉＋GM114．17±0．64＃＃▲▲△△14．94±0．33＃＃▲▲△△14．08±0．55＃＃▲▲△△0．137±0．009＃＃▲▲△△0．142±0．007＃＃▲▲△△0．140±0．007＃＃▲▲△△

3 讨论

缺血中心区和周围的半暗带组成局灶性脑缺血病灶，缺血再灌注时产生的氧自由基可导致脂质过氧化反应从而改变其功能，细胞膜通透性增强，线粒体肿胀破裂并诱发细胞凋亡，其主要发生在半暗带。如果能阻止凋亡的发展，就有可能减轻脑缺血时脑损伤程度，缩小梗死范围，因此脑缺血后神经元凋亡机制以及基于细胞凋亡为靶点的抗脑缺血研究成为研究的热点［7］。

在近年来研究［8］的抗凋亡信号通路中，PI3K／Akt信号通路已成为热门之一，PDK1是AGC蛋白激酶家族里面的一种丝氨酸／苏氨酸激酶，对控制细胞生长分化生存蛋白质翻译和葡萄糖代谢具有重要意义。GSK3β是Akt下游一重要靶向分子，可通过激活糖原合成酶调节细胞能量代谢过程，在细胞的生长、分化、突变和凋亡等生命活动中具有重要的调控作用，是多种信号途径的交汇点，具有广泛的底物［9］，参与多种信号的负调控。有研究［10］表明，在多种正常组织细胞及多类肿瘤细胞中，GSK3β活性上调可进一步激活细胞凋亡的相关蛋白激酶，从而诱导细胞凋亡。有研究［11］表明抑制PDK1的活性可以促使癌细胞凋亡或抑制其增殖。

Candelise et al［12］通过对急性脑梗死患者联合使用GM1及依达拉奉疗效的观察，发现联合用药不仅增强神经营养因子功能的作用，而且可以更好地发挥改善脑组织代谢及修复病变的脑组织，减少脑组织继发梗死的作用。研究结果显示，在缺血半暗带，再灌注3、7、14 d各时间点，模型组PDK1、GSK3β蛋白表达的平均吸收光密度和阳性面积单位均显著高于假手术组，说明脑缺血后PDK1、GSK3β蛋白表达增加，PI3K／Akt信号通路存在激活现象；再灌注各时间点，GM1组、依达拉奉组PDK1蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著高于模型组，可见GM1、依达拉奉均可促进PDK1表达，从而使Akt活性增强，抗神经细胞凋亡；GM1组、依达拉奉组GSK3β蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著低于模型组，说明GM1、依达拉奉均可抑制GSK3β表达，从而抑制细胞凋亡的相关蛋白激酶的激活；再灌注各时间点，GM1联合依达拉奉组PDK1蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著高于GM1组或依达拉奉组，GSK3β蛋白表达平均吸收光密度和阳性面积单位显著低于GM1组或依达拉奉组，说明GM1联合依达拉奉在促进PDK1及抑制GSK3β表达上较单独用药效果更佳。

综上所述，GM1联合依达拉奉能增强缺血半暗带PDK1蛋白表达，抑制GSK3β蛋白表达，调节PI3K／Akt信号通路，抗脑缺血神经细胞凋亡，并且其作用明显优于单独使用GM1或依达拉奉。但PI3K／Akt信号通路及其相关分子如何实现对神经细胞凋亡的调控以及分子机制有待进一步的研究。

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Effects of monosialoganglioside and edaravone on expressions of PDK1，GSK3β protein in ischemic penumbra after focal cerebral ischemia／reperfusion in MCAO rats

Li Xiaoyan1，2，Zhou Nong1
（1Dept of Neurology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Neurology，The Second People’s Hospital of Anhui，Hefei 230011）

ObjectiveTo investigate the effects of GM1 and Edaravone on expressions of PDK1，GSK3β protein in ischemic penumbra after local cerebral ischemia／reperfusion in intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery rats and its related mechanism．Methods The local cerebral ischemia／reperfusion model was established by intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery．The animals were randomly divided into pseudo surgery group，model group，GM1 group，Edaravone group and GM1 and Edaravone group．Using the techniques of immuno-histochemical sraining，the expressions of PDK1，GSK3β protein were observed at 3，7 and 14 days in ischemic penumbra．Results In ischemic penumbra，3，7，14 days each time point，a value and positive unit of the PDK1 protein expression in GM1 and Edaravone groups were higher than those in GM1 or Edaravone groups（P＜0．05），model groups（P＜0．01）；a value and positive unit of the GSK3β protein expression in GM1 and Edaravone groups were lower than those in GM1 or Edaravone groups（P＜0．01），model groups（P＜0．01）．Conclusion GM1 and Edaravone resist neural cell apoptosis，regulate PI3K／Akt signal transduction pathway by enhancing PDK1 protein and restraining GSK3β expression after local cerebral ischemia／reperfusion in artery rats．

monosialoganglioside；edaravone；brain ischemia／reperfusion；3-phosphoinositide dependent protein kinase 1；glycogen synthase kinase-3β；apoptosis

R 743

A

1000－1492（2015）03－0302－05

2014－12－31接收

1安徽医科大学第一附属医院神经内科，合肥 230022

2安徽省第二人民医院神经内科，合肥 230011

李晓艳，女，硕士研究生；周 农，男，主任医师，责任作者，E-mail：zhounong＠foxmail．com