罗格列酮对耐药乳腺癌细胞影响的研究

陈皖京，汤 铜，钱 波，李 佳，田 多，郑 璐

罗格列酮对耐药乳腺癌细胞影响的研究

陈皖京，汤 铜，钱 波，李 佳，田 多，郑 璐

目的探讨罗格列酮（ROS）对耐他莫西芬（TAM）的乳腺癌细胞MCF-7／TAM体外生长的影响，及对其耐药性的逆转效果和作用机制方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色分析法测定ROS作用于MCF-7／TAM细胞后的抑制率及逆转耐药的效果；采用流式细胞术检测ROS作用MCF-7／TAM细胞后的凋亡率；采用实时定量荧光PCR技术检测ROS作用MCF-7／TAM细胞后对FOXA1、ERα、ErbB-2和P53基因表达的影响结果ROS干预MCF-7／TAM细胞后，呈量－效和时－效关系抑制其增殖。半数抑制浓度（136 μmol／L）的ROS对MCF-7／TAM细胞具有明显的逆转耐药效果，逆转耐药倍数为2．05倍。高浓度可诱导MCF-7／TAM细胞凋亡。半数抑制浓度（136 μmol／L）的ROS作用MCF-7／TAM细胞后，能够上调FOXA1、ERα和P53基因表达水平（P＜0．05），下调ErbB-2基因表达水平（P＜0．05）结论ROS可抑制MCF-7／TAM细胞增殖，高浓度ROS可诱导其凋亡，其机制可能与上调P53基因表达有关。ROS可逆转MCF-7／TAM细胞的耐药性，逆转机制可能与上调FOXA1和ERα基因表达，下调ErbB-2基因表达有关。

罗格列酮；他莫西芬；乳腺癌细胞；FOXA1；ERα；ErbB-2；P53

他莫西芬（tamoxifen，TAM）是作为雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌患者内分泌治疗的主要药物，可有效降低患者的死亡率和复发率，但长期使用会产生耐药继而限制其疗效。罗格列酮（rosiglitazone，ROS）作为胰岛素增敏剂广泛应用于糖尿病的临床治疗，最近研究［1］显示ROS可抑制乳腺癌细胞增殖，但其对TAM耐药的乳腺癌细胞MCF-7／TAM的增殖和耐药性的影响尚无报道。该研究观测了ROS在体外对MCF-7／TAM细胞的增殖、凋亡和耐药性的影响，以探索ROS在抑制耐药细胞增殖和恢复耐药细胞对TAM敏感性中的作用，为临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1．1 细胞系人乳腺癌细胞系（MCF-7）和耐TAM乳腺癌细胞系（MCF-7／TAM）由安徽医科大学第一附属医院中心实验室馈赠，MCF-7／TAM细胞株已用浓度为10－6mol／L的TAM维持1年，实验前撤药1周；上述两种细胞分别培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中和含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640培养基中。

1．2 主要试剂及器材胎牛血清（杭州四季青公司），改良型RPMI-1640培养基和DMEM培养基（美国Gibco公司）；TAM（天津希恩思公司），批号：T-00470，1 g装；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）及ROS（美国Sigma公司），DMSO批号：D5879，100 ml装；ROS批号：R2408，10 mg装；RNeasy Mini Kit和SYBR Green Mix（德国Qiagen公司）；反转录试剂盒（美国Promega公司）；青链霉素和含0．02% EDTA的0．25%胰蛋白酶（杭州吉诺公司）；FOXA1、ERα、ErbB-2、P53及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；Annexin V-FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博公司）；酶标仪（美国莱姆德公司），型号为PRA ELX800；梯度PCR仪（德国Biometra公司），型号为T-Gradient；荧光定量PCR仪（德国Qiagen公司），型号为Rotor-Gene 3000。

1．3 药物制备MTT用PBS配制成浓度为5 mg／ml，过滤除菌于4℃保存。TAM用无水乙醇配制成浓度为10－3mol／L的储存液，过滤除菌，－20℃分装避光保存。ROS用DMSO配制成浓度为10－3mol／L的储存液，过滤除菌，－20℃分装避光保存。实验时按所需浓度用不含血清的改良型RPMI-1640培养液稀释。

1．4 MTT实验取生长对数期的MCF-7／TAM细胞（5×104个／ml）接种于96孔板内，每孔加细胞悬液100 μl，置于37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h后更换培养液，实验组以等差稀释的方法由低到高分别加入0、50、100、150、200、250 μmol／L 6个浓度，每个浓度设6个复孔；对照组加同等体积的培养液。继续孵育24、48、72 h后，采用常规MTT方法检测。吸出培养基，每孔加MTT（5 mg／ml）20 μl，4 h后吸出培养基，每孔加150 μl DMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪（490 nm）测定各孔光密度（optical density，OD）值，计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）＝（1－实验组OD值／对照组OD值）× 100%。

1．5 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的MCF-7／TAM细胞（25×104个／ml）接种于6孔板内，每孔加细胞悬液2 ml，置于37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h后更换含不同浓度ROS（150、200、250 μmol／L）的培养液，继续孵育48 h后消化收集细胞，冰浴PBS洗2遍，用400 μl Annexin V结合缓冲液重悬细胞，加5 μl Annexin V-FITC染色液避光于冰上孵育15 min后，加10 μl Propidium Iodide染色液避光于冰上孵育5 min，细胞样品逐一上机检测，同一浓度设3个复孔，试验同时设置不加药物的空白对照组。

1．6 耐药倍数与逆转耐药倍数测定实验共分为3组：①浓度梯度的TAM作用于MCF-7组；②浓度梯度的TAM作用于MCF-7／TAM组；③ROS（136 μmol／L）预处理MCF-7／TAM 48 h后，浓度梯度的TAM作用于MCF-7／TAM组。48 h后用MTT法测定各组细胞抑制率，用SPSS 13．0统计软件计算出各组TAM的IC50值。根据公式计算耐药倍数和逆转耐药倍数。耐药倍数＝耐药细胞IC50／敏感细胞IC50；逆转耐药倍数＝耐药细胞逆转前IC50／耐药细胞逆转后IC50。

1．7 Real time PCR技术检测FOXA1、ERα、ErbB-2和P53基因表达实验共分为3组：①MCF-7组；②MCF-7／TAM组；③ROS（136 μmol／L）预处理48 h后的MCF-7／TAM组。3组细胞分别培养48 h，用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit提取RNA，测A260和A280的吸光度，计算出RNA浓度，采用Promega公司的逆转录酶按20 μl体系将5 μl RNA逆转录成cDNA。反应体系为：10×Buffer 2 μl、dNTPs 2 μl、Olifol（dT）1 μl、MgCl24 μl、RNA inhibitor 0．5 μl、RT酶0．7 μl、RNA模板5 μl、H2O 5 μl，逆转录反应条件：42℃30 min，95℃5 min，0℃5 min。FOXA1的上游引物序列：5′-CGCTTCGCACAGGGCTGGAT-3′，下游序列为：5′-TGCTGACCGGGACGGAGGAG-3′，扩增长度为144 bp。ERα的上游引物序列为：5′-CCACCAACCAGTGCACCATT-3′，下游序列为：5′-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTTC-3′，扩增长度为108 bp。ErbB-2的上游引物序列为：5′-AAACCTGGAACTCACCTA-3′，下游序列为：5′-ATAGTTGTCCTCAAAGAGC-3′，扩增长度为163 bp。P53的上游引物序列为：5′-GGCCCACTTCACCGTACAA-3′，下游序列为：5′-GTGGTTTCAAGG CCAGATGT-3′，扩增长度为156 bp。GAPDH的上游引物序列为5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3′，下游序列为：5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGGATTT-3′，扩增长度为209 bp。实时定量荧光PCR反应体系为：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，RNase-free water 3．5 μl，FOXA1、ERα、ErbB-2、P53及GAPDH（10 μmol／L）上下游引物各0．25 μl，cDNA 1 μl。在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应条件为：95℃5min，95℃30 s，60℃15 s，共40个循环，溶解曲线按照Rotor-gene 3000机器SYBR Green染料方案设置。将目的基因在敏感细胞和药物处理过后的耐药细胞内，相对于耐药细胞的表达差异倍数用2－ΔΔCt方法计算来表示［2］。ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（GAPDH基因），－ΔΔCt＝－（ΔCt敏感细胞／ROS处理的耐药细胞－ΔCt耐药细胞）。当2－ΔΔCt＞1，目的基因表达上调，反之下调。

1．8 统计学处理采用SPSS 13．0统计软件，两组数据比较时采用t检验，多组间比较时用方差分析。

2 结果

2．1 ROS抑制MCF-7／TAM细胞增殖的作用将ROS从250 μmol／L等差稀释至0 μmol／L，由低浓度到高浓度分别作用于MCF-7／TAM细胞24、48和72 h，作用24 h后其增殖抑制率从14．2%升为62．1%，作用48 h后其抑制率从21．7%升为64．4%，作用72 h后其抑制率从33．7%升为74．4%，ROS对MCF-7／TAM细胞的抑制作用与浓度和时间呈正相关。依据酶标仪的数据结果，采用SPSS 13．0软件计算出ROS作用MCF-7／TAM细胞48 h后的50%抑制率（IC50）浓度为136 μmol／L。见图1。

2．2 MCF-7／TAM细胞的耐药倍数及ROS逆转耐药倍数浓度梯度TAM单独作用于MCF-7细胞，48 h的IC50值为（6．81±0．02）μmol／L；浓度梯度TAM单独作用于MCF-7／TAM细胞，48 h的IC50值为（17．92±0．03）μmol／L，耐药倍数为2．63（t＝51．20，P＜0．05）。半数抑制浓度的ROS（136 μmol／L）预处理MCF-7／TAM细胞48 h后，浓度梯度TAM单独作用于MCF-7／TAM细胞，48 h的IC50值为（8．76±0．01）μmol／L，逆转耐药倍数为2．05（t＝65．32，P＜0．05）。表明半数抑制浓度的ROS可以部分恢复MCF-7／TAM细胞对TAM的敏感性。见图2。

2．3 ROS诱导MCF-7／TAM细胞凋亡将ROS以浓度为150、200、250 μmol／L分别作用MCF-7／TAM细胞48 h后，细胞凋亡率分别为（16．20± 0．30）%、（22．53±0．15）%和（27．53±0．35）%，与对照组的（3．23±0．04）%相比，凋亡率增加（F＝5559，P＜0．05）。见图3。

2．4 ROS对基因表达的影响从扩增曲线和溶解曲线可见待测基因均已进入扩增的平台期，产物特异性较好，说明反应条件设定准确。统计分析结果显示：①FOXA1基因在敏感细胞MCF-7中的表达是耐药细胞MCF-7／TAM的（2．66±0．84）倍（t＝5．52，P＜0．05），FOXA1基因在ROS处理后的耐药细胞中的表达是未做处理的耐药细胞的（3．16±0．14）倍（t＝37．79，P＜0．05）。②雌激素受体ERα基因在敏感细胞MCF-7中的表达是耐药细胞MCF-7／TAM的（8．68±0．54）倍（t＝27．75，P＜0．05），ERα基因在ROS处理后的耐药细胞中的表达是未做处理的耐药细胞的（5．01±0．90）倍（t＝9．63，P＜0．05）。③表皮生长因子受体ErbB-2基因在敏感细胞MCF-7中的表达是耐药细胞MCF-7／TAM的（0．06±0．01）倍（t＝9．50，P＜0．05），ErbB-2基因在ROS处理后的耐药细胞中的表达是未做处理的耐药细胞的（0．52±0．07）倍（t＝11．87，P＜0．05）。④P53基因在细胞MCF-7中的表达是耐药细胞MCF-7／TAM的（4．42±1．76）倍（t＝5．85，P＜0．05），P53基因在ROS处理后的耐药细胞中的表达是未做处理的耐药细胞的（1．76±0．51）倍（t＝5．91，P＜0．05）。见图4。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%，严重影响女性身心健康。有研究［2－3］显示单独服用TAM 5年可使ER阳性的早期乳腺癌患者年死亡率降低31%，复发率降低47%。但是，近年来临床上TAM耐药的出现严重限制了其疗效。目前耐药机制的研究［4－5］以ERα缺失和表皮生长因子通路上调为主，现发现先锋因子FOXA1也参与耐药机制的发生［6］。然而针对TAM耐药的问题，目前临床的处理主要为不同抗雌激素药物的交替使用、异常信号通路的靶向阻断、新靶点及多药联合治疗，但疗效有限，且有一定的副作用［7］。

刘朝俊等［8］报道称2型糖尿病与乳腺癌密切相关。一项乳腺癌内分泌治疗的回顾性分析提示，接受内分泌治疗的患者较未接受者其糖尿病发生率明显升高［9］。

ROS属于噻唑烷二酮类降糖药物，主要通过结合并激动过氧化物酶体增殖活化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ）发挥作用。研究［10］显示PPARγ在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤细胞中均有表达。有报道［1］称ROS可抑制乳腺癌MCF－7细胞的增殖。P53基因是重要的抑癌基因之一，与乳腺癌的生长、凋亡密切相关，Moon et al［11］发现ROS可促进P53基因表达。Talbert et al［12］却发现小剂量（10 μmol／L）ROS可促进MCF-7细胞增殖，与小剂量ROS通过ERa途径和ERKMAPK途径激活雌激素受体反应元件（estrogen receptor response element，ERE），从而上调ERα表达有关。Elstner et al［13］发现PPARγ配体激动剂曲格列酮可显著抑制表皮生长因子受体ErbB-2蛋白表达。Varley et al［14］发现FOXA1的表达调控受PPARγ的调节。

以上研究结果为ROS抑制耐TAM乳腺癌细胞MCF-7／TAM的增殖，恢复其对TAM的敏感性提供了可能。本研究结果显示ROS可抑制MCF-7／TAM细胞增殖，且高浓度可诱导其凋亡。经ROS处理后，P53基因表达上调，与抑制耐药细胞的增殖相关。对比MCF-7／TAM细胞和MCF-7细胞的基因表达情况，发现MCF-7／TAM的耐药机制与ERα和FOXA1基因表达下调、ErbB-2基因表达上调相关。MCF-7／TAM细胞经ROS处理后，对比处理前其ERα、FOXA1基因表达上调，ErbB-2基因表达下调，逆转耐药倍数为2．05倍，提示ROS可通过改变耐药相关基因的表达来恢复乳腺癌耐药细胞对TAM的敏感性。

综上所述，ROS以其抑制耐药乳腺癌细胞MCF-7／TAM增殖，恢复耐药细胞对TAM的敏感性，避免乳腺癌向ER功能缺失的不良表型发展，降低乳腺癌合并糖尿病患者的血糖，降低内分泌治疗所引起血糖升高的风险，临床副作用小等优势，为临床治疗耐TAM乳腺癌提供了实验基础和新的思路。至于ROS逆转耐药的其他途径及其诱导耐药细胞凋亡的具体机制有待进一步研究。

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Effects of rosiglitazone on the drug-resistant breast cancer

Chen Wanjing，Tang Tong，Qian Bo，et al
（Dept of General Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the proliferation inhibition and the reverse effects as well as the mechanisms of rosiglitazone（ROS）on human breast cancer cells resistant to tamoxifen（MCF-7／TAM）in vitro．Methods The inhibitive rate and reverse effects of ROS on MCF-7／TAM cells were detected by MTT assay．The apoptotic rate of ROS on MCF-7／TAM cells were detected by flow cytometry．The expression changes of FOXA1，ERα，ErbB-2 and P53 of MCF-7／TAM cells which dealed with ROS were detected by real-time quantitative PCR．Results ROS could inhibit the proliferations of MCF-7／TAM cells through dose-effect and time-effect relationships．ROS had a significant reversal of drug resistance of MCF-7／TAM cells．The dose of 50%inhibitory concentration（136 μmol／L）reversed the resistance by 2．05 folds．High concentration of ROS could induce the MCF-7／TAM cells apoptosis．The expressions of FOXA1，ERα and P53 were increased after ROS effected on MCF-7／TAM cells at the dose of 50%inhibitory concentration（136 μmol／L）（P＜0．05）．While，the expressions of ErbB-2 were induced by ROS with the same concentration（P＜0．05）．Conclusion The effects of proliferation inhibition and apoptosis of ROS on MCF-7／TAM cells may be related to down-regulating P53 expression．ROS can reverse the drug resistance of MCF-7／TAM cells，and the reverse mechanisms maybe relate to up-regulating FOXA1 and ERα expression as well as down-regulating ErbB-2．

rosiglitazone；tamoxifen；human breast cancer cells；FOXA1；ERα；ErbB-2；P53

R 737．9

A

1000－1492（2015）03－0285－05

2014－11－12接收

安徽省自然科学基金项目（编号：1308085QH152）

安徽医科大学第二附属医院普通外科，合肥 230601

陈皖京，男，硕士研究生；汤 铜，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：tt20164＠126．com