一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法

任婷月，周万里，张利群，毕春元，李敬龙

1(齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南，250353)

2(山东省科学院生物研究所山东省生物传感器重点实验室，山东济南，250014)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种氧化还原酶，在O2充足条件下，它能够快速专一地催化β-D-葡萄糖为 β-D-葡萄糖酸和 H2O2［1］。它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，微生物中的主要生产菌株有黑曲霉和青霉［2］。由于GOD天然无毒，无副作用，因而在食品，医药等行业中应用极为广泛。在食品工业方面，它能起到去除葡萄糖，脱氧保鲜，杀菌以及葡萄糖定量分析的作用［3］，如用于啤酒、果汁、奶制品等的除氧;鱼、虾、蟹等的保鲜;蛋品加工的脱糖;面制品的增筋等。

葡萄糖氧化酶在使用和科研实验中都需要进行酶活力的测定。目前，它的测定方法主要有以下几种，一种是滴定法［4］，此法虽然简便易行，但是误差比较大，灵敏度比较低;另外一种是连续分光光度法［5-6］，此法虽然灵敏度较高，但是测定值较低，且数据处理较复杂，成本较高;还有一种利用葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-苯胺衍生物或染料隐性体偶联反应体系测定［7］，这种方法非常灵敏，但也存在显色不稳定、短时间内容易褪色，数据重复性不好等缺点，这样就限制了葡萄糖氧化酶活力的测定在科研实验中的应用。本研究利用生物传感分析仪检测葡萄糖质量浓度［8］的工作原理，设计了葡萄糖氧化酶活力的测定方法，用过氧化氢电极检测葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2的浓度从而得到葡萄糖氧化酶的活力单位［9］，用已知酶活力的葡萄糖氧化酶作标准检测未知酶活力的葡萄糖氧化酶，在仪器上直接显示酶活力单位，实现了葡萄糖氧化酶的快速测定，并与滴定法进行了对比研究。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

SBA-40C型葡萄糖生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所;梅特勒DELTA320pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;50 mL酸式滴定管，武汉华威化工仪器有限公司。

葡萄糖氧化酶标准液，用pH 6.5磷酸缓冲液配制成100 U/mL葡萄糖氧化酶液，2～8℃保存。

无水NaH2PO4，无水Na2HPO4，配制成0.2 mol/L磷酸盐缓冲液;0.1 mol/L标准HCl溶液和0.1 mol/L的标准NaOH溶液，按照国标GB/T601-2002标定。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

无水葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖氧化酶，Sigma公司;稀释水、SBA专用缓冲液，山东省科学院生物研究所自行研制;葡萄糖氧化酶液(＞1 500 U/mL)，山东省生物传感器重点实验室保藏。

1.2 工作原理

SBA-40C型生物传感分析仪是以固定化酶为关键元件，由微电脑控制分析过程的智能化仪表，采用固定化葡萄糖氧化酶膜复合H2O2型电极测定葡萄糖的生化反应如下:

酶反应生成的H2O2透过酶膜后在铂金电极表面失去电子，铂电极获得电子产生电流信号，此电流信号与H2O2的浓度成比例，而H2O2浓度与底物浓度成线性比例关系。通过比较被测物与标准样品产生的H2O2量，就可计算出被测样品中底物的含量。我们依据生物传感分析仪测定葡萄糖质量浓度的工作原理，设计了葡萄糖氧化酶酶活力的测定方法。

首先，用酶液替代待测液，然后，用含一定葡萄糖量的缓冲液替代原缓冲液(葡萄糖浓度保持过量)，最后，用空酶膜替代固定化的葡萄糖氧化酶酶膜，从而构成一个检测酶活的系统。测定时，用已知活性单位的葡萄糖氧化酶溶液标定仪器并进行线性校正，然后将待测样品稀释后进行测定，仪器显示数值乘以稀释倍数即为被测定样品中的葡萄糖氧化酶活力单位。

1.3 测定方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶液样品的制备

经过实验，对于过氧化氢电极法，葡萄糖氧化酶的活力范围在0～100 U/mL时线性范围关系较好，故将待测葡萄糖氧化酶液稀释100倍进行酶活的测定。

用1 000 μL移液枪准确吸取待测酶液1 000 μL于80 mL小烧杯中，用少量pH 6.5的磷酸盐缓冲液进行稀释，然后用玻璃棒转移到100 mL容量瓶中，用pH 6.5的磷酸盐缓冲液多次洗涤小烧杯，并将洗涤后液体全部转移到容量瓶，最后定容到100 mL，得到酶液A1，用同样的方法得到A2，A3，做平行实验。

1.3.2 仪器定标和样品测定

采用含葡萄糖1%，pH=6.5的磷酸盐缓冲液作为流动相，充满传感器的管道和反应池，采用100 U/mL葡萄糖氧化酶溶液作为标准液。开机后，用微量进样器取25 μL葡萄糖氧化酶标准液迅速注入反应池内，20s后仪器显示酶相对活性并自动清洗，清洗结束后再取25 μL上述标准液注入反应池，如果2次测量误差不超过2%，则提示定标通过，自动清洗后即可测定样品，进样量为25 μL，每个样品重复测定3次。

葡萄糖氧化酶活力=样品测定值×稀释倍数

1.4 滴定法

对于滴定法，葡萄糖氧化酶的活力范围在1.125～5.321 U/mL时线性范围关系较好［10］，故将待测葡萄糖氧化酶液稀释1 000倍进行酶活力的测定。

葡萄糖氧化酶液样品的制备:用100 μL移液枪准确吸取待测酶液100 μL于80 mL小烧杯中，用少量pH 6.5的磷酸盐缓冲液进行稀释，然后用玻璃棒转移到100 mL容量瓶中，用pH 6.5的磷酸盐缓冲液多次洗涤烧杯，并将洗涤液全部转移到容量瓶，最后定容到100 mL，得到酶液B1，用同样的方法得到B2，B3，做平行实验。

滴定法具体操作步骤按照文献［10］进行，每个酶液样品平行测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 最佳pH实验

分别采用 pH 为 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸缓冲液作为流动相进行实验，不同pH值的磷酸盐缓冲液对葡萄糖氧化酶的活力测定的影响见图1。结果表明:pH 6.5时的响应值最高，所以选取pH 6.5的缓冲液进行实验。

图1 pH对测定结果的影响Fig.1 The effect of pH on the determination

2.2 线性实验

首先，按照1.3.2的方法用25 μL，100 U/mL葡萄糖氧化酶标准液标定仪器，定标通过后，再取12.5 μL标准液注入反应池，待反应结束后，按动“线性校正”键，则仪器自动完成线性校正。然后，分别对0、20、40、60、80、100 U/mL 葡萄糖氧化酶标准样品进行测定，测定结果见图2。

以浓度作为X值，响应值作为Y值进行回归分析，得线性回归方程:Y=1.001 4X+0.095 2，r=0.999 1。其中X为浓度，Y为响应值，r为相关系数。结果表明:用本系统测定葡萄糖氧化酶活力时，进行线性校正后，进样量在0～100 U/mL之间表现出良好的线性关系。

图2 线性实验Fig.2 Test of lineary

2.3 精密度实验

连续10次对100 U/mL的葡萄糖氧化酶样品进行测定，结果见表1。结果表明:精密度性实验相对标准偏差(RSD)为0.63%，表明该检测葡萄糖氧化酶活力的方法有较好的精确性。

2.4 回收率实验

准备6份10 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，分别加入不同活力单位的葡萄糖氧化酶标准品，作回收率实验，结果见表2。结果表明，回收率在97.9% ～101.5%，相对标准偏差为1.51%，表明此方法检测葡萄糖氧化酶活力具有良好的准确性。

表1 精密度实验Table 1 Test for precision

表2 回收率实验Table 2 Test for recovery

2.5 对比试验

分别采用过氧化氢电极法与滴定法对实验室保藏葡萄糖氧化酶液进行测定。

2.5.1 过氧化氢电极法

将葡萄糖氧化酶液稀释100倍之后，测定结果见表3。

表3 过氧化氢电极法对葡萄糖氧化酶活的测定Table 3 The determination of glucose oxidase activity by hydrogen peroxide electrode method

2.5.2 滴定法

将葡萄糖氧化酶液稀释1 000倍之后，测定结果见表4。

表4 滴定法对葡萄糖氧化酶活的测定Table 4 The determination of glucose oxidase activity by titration

实验结果表明:由过氧化氢电极法所测的葡萄糖氧化酶活力为4 100 U/mL，由滴定法所测的葡萄糖氧化酶活力为4 111 U/mL，2种方法对葡萄糖氧化酶活力的测定结果相差不大，在误差允许的范围内。

3 结论

本研究利用SBA-40C型生物传感分析仪建立了一种葡萄糖氧化酶活力的快速测定方法，通过过氧化氢电极检测葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2的浓度从而得到葡萄糖氧化酶的活力单位，并采用该方法和滴定法对山东省生物传感器重点实验室保藏的葡萄糖氧化酶液进行了酶活测定。由结果可以看出:该检测系统的最佳反应pH为6.5，测定时间20 s，操作周期小于60 s，连续10次测定RSD值为0.63%，0～100 U/mL的范围内线性良好，r=0.999 1，并且该方法与滴定法的检测结果相差不大，在误差允许的范围内。滴定法是目前测定葡萄糖氧化酶活力的主要方法，但该方法存在操作步骤繁琐，灵敏度较低等缺点，过氧化氢电极法快速，准确，专一性好，操作简单，且精密度较高，是一种高效的分析方法。结果表明:用过氧化氢电极测定葡萄糖氧化酶的活力是一种理想的快速测定方法。

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