Real-Time PCR检测Bcl-2和Bax基因在脊髓钝挫伤大鼠中的表达

石兰岚 黄 婷 罗 辑 钟占琼夏庆杰 张 晓△ 王廷华

1（成都医学院 基础实验技术中心，成都610041）

2（四川大学 华西校区神经疾病转化中心，成都610083）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后除了创伤造成的原发性损伤外，脊髓局部还将发生一系列继发性病理改变，其造成的损害超过原发性损伤［1］。脊髓神经阻滞损伤后再生不良，是继发性损伤不断加重所致，而细胞凋亡是继发性损伤细胞死亡的主要方式，大量神经元凋亡往往导致神经功能永久性丧失［2-4］。目前有很多研究报道，Bcl-2和Bax是调节细胞凋亡的主要基因，两者表达量的多寡直接与细胞凋亡有关。B细胞淋巴瘤／白血病-2（B-cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2），是主要的抗凋亡基因，它能有效地抑制细胞凋亡，是迄今研究最深入，最广泛的凋亡调控基因［5］。Bax即（bcl-2associated X protein），是bcl-2的拮抗基因，两者都属于bcl-2基因家族成员，通过编码相应功能蛋白起作用。查阅文献发现，脊髓损伤后特别是脊髓钝挫伤后Bcl-2和Bax基因mRNA水平的改变多是使用普通RTPCR来检测，但是这种方法在只能定性不能定量，且易引起PCR产物的交叉污染［6］。近年来，实时荧光定量PCR的应用越来越广泛，而且它与常规PCR相比特异性更强、敏感性高，且重复性好［7］。故本研究采用Real-time PCR实时荧光定量PCR来检测脊髓钝挫伤模型大鼠Bcl-2和Bax基因的表达变化，为脊髓损伤机制的进一步研究提供证据。

1 方法

1．1 实验动物及分组

健康成年雌性SD大鼠72只，体重180～220g，购自四川大学华西医学实验动物中心，随机分为假手术组、损伤6h组、损伤12h组、损伤1d组、损伤3d、损伤5d组、损伤7d组、损伤14d组和损伤28d组，每组8只。

1．2 脊髓钝挫伤模型制备

1．2．1 麻醉 3．6%水合氯醛（1ml／100g），称取大鼠体重，根据体重计算麻药计量，麻醉途径为腹腔注射（i，p），记录麻醉时间，并观察麻醉效果，待瞳孔反射消失，肌张力减弱及疼痛反射消失，标志麻醉成功。

1．2．2 固定与编号 麻醉成功后，将大鼠以俯卧位姿势固定于特制手术台，根据实验计划进行编号。染色时最好剪掉所涂部位的毛，并沿逆毛方向涂抹染料。

1．2．3 具体方法 在大鼠颈部摸触到的最高点为第二胸椎棘突，沿脊髓脊柱向后约3～4cm，有一明显的圆钝凸起即为第十胸椎棘突，以其为中心进行备皮，并用碘伏消毒备皮区域。以T10棘突为中心，沿脊髓方向切开皮肤，用止血钳钝性分离皮肤与筋膜，在剪开粘膜，用撑开器撑开皮肤与筋膜，暴露出肌肉，再次进行定位T10，然后以T9为中心，手术刀沿脊柱两侧剖开椎旁肌，剪断T8、T9、T10棘突之间的棘间韧带，以充分暴露T9棘突，沿椎板棘突形状剔除T9椎旁肌，以充分暴露T9椎板，用镊子轻轻夹住T8棘突，轻轻提起脊柱，用咬骨钳咬除T9棘突，从T9和T10椎体之间间隙入手，咬除T9椎板，暴露脊髓。记录整个剥除椎板时间。

1．2．4 将大鼠放置在自制打击仪上，把打击棒一端提起使其与磁力吸引器接触，按住开关后，打击棒被吸在磁力吸引器上，旋转调节旋钮，将打击棒下端与大鼠脊髓水平面处于同一水平面上，按下调零按钮，使示数归零。再次调节旋钮，将10g中的打击棒调节到高度为30mm处。用碘伏消毒打击棒下端，松开开关，打击棒自由落体，砸伤暴露出的脊髓，可见大鼠后股匍动或是鼠尾摆动。打击完毕时立即提起打击棒，并用棉签止血，记录打击时间。清理伤口后，缝合肌肉，筋膜和皮肤，并用碘伏消毒伤口。注射1ml青霉素（2万单位／只）和2ml葡萄糖。术后每日排尿和喂食等护理两次。

1．3 组织总RNA的提取

（1）将组织和TRIZOL裂解液一起转移入5ml匀浆器，匀浆至均匀、不粘、无颗粒后入EP管①。4℃12000r／min离心10min，取上清液入EP管②；

（2）加入200μl氯仿，剧烈振荡10-15s，室温静置15min，4℃12000r／min离心15min，观分层；

（3）取上清至EP管③，加入500μl异丙醇，振荡10～15s，-20℃静置10min，4℃12000r／min离心8min（可见管底有透明的胶状沉淀）后弃去上清液；

（4）加入1ml预冷的75%乙醇洗涤RNA，轻轻振荡几次后，-20℃储存。

1．4 Real-Time PCR

各组大鼠麻醉后，取钝挫伤段脊髓0．3cm用Real-Time PCR检测Bcl-2和Bax的基因表达量。按说明书将组织裂解提取RNA，然后将RNA逆转录合成cDNA第一条链。以cDNA为模板进行PCR反应，放入定量PCR仪按两步法进行PCR扩增。条件如下：94℃2min，94℃20s，50℃～60℃（依据引物的 Tm 值可变）20s，60℃40s，45cycles；引物序列为：Bcl-2上游引物：GAGGATTGTGGCCTTCTTTG；下游引物：GTTCCACAAAGGCATCCCAG；探针：CCCCTGGTGGACAACATCGC；Bax上游引物：TGGAGCTGCAGAGGATGATT；下游引物：CAGGGCCTTGAGCACCAGTT；探针：CAGACTCCCCCCGAGAGGTC；和β-actin上游引物：GAAGATCAAGATCATTGCTCCT；下游引物：TACTCCTGCTTGCTGATCCA；探针：CTGTCCACCTTCCAGCAGA。最后得到S形动力学曲线。读取Ct值，人工校正后按2-ΔCt计算出相对表达量。

1．5 统计学分析

所有统计数据结果用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 17．0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果

大鼠脊髓钝挫伤后Bcl-2和Bax基因表达变化

Real-Time PCR显示脊髓钝挫伤后Bax基因表达变化如下，假手术组Bax水平较高，脊髓钝挫伤6 h后Bax表达较假手术组显著降低（P＜0．01），脊髓钝挫伤12h及1dBax表达水平相对升高，较6h具有显著性差异（P＜0．01），钝挫伤3d及5d其表达水平下降，较1d差异具有明显统计学意义。在钝挫伤14d恢复至6h组水平（见图1）。

图1 Bax在脊髓钝挫伤大鼠不同时间点基因相比表达量Fig 1 The relative gene expression of Bax at different time in spinal cord contusion rats

Real-Time PCR显示脊髓钝挫伤后Bcl-2基因表达变化如下，假手术组Bcl-2水平较高，在脊髓钝挫伤6h显著下降（与sham组相比，P＜0．01），12h呈现一个上升的趋势，这时Bcl-2表达水平较6h比有显著升高（P＜0．01），随即在顿挫伤1d时Bcl-2水平又下降（与12h比，P＜0．05），持续至7d，钝挫伤14d时Bcl-2基因表达水平相对升高，与1d组比有显著性差异（P＜0．01），28d时其表达仍明显低于sham 组水平（与sham 组相比，P＜0．01）（见图2）。

图2 Bcl-2在脊髓钝挫伤大鼠不同时间点基因相比表达量Fig 2 The relative gene expression of Bcl-2at different time in spinal cord contusion rats

3 讨论

脊髓损伤常导致不同程度的肢体残障，感觉及运动功能损伤，给患者、家庭和社会带来极大痛苦及沉重经济负担，一直是神经科学及骨科学的一个热点。但目前脊髓损伤机制尚不清楚，仍无有效的治疗措施。近年来的研究显示，中枢神经系统损伤后，神经细胞的凋亡在继发性损伤中发挥重要作用［8］。

本实验发现，在假手术组，Bax的mRNA水平处于较高的水平，在SCI后6h立即下降，两组相比差异具有明显统计学意义。12h后Bax较6h有明显上升，此时Bax mRNA与假手术组相比虽有升高但差异无明显统计学意义（P＞0．05）。1d时，Bax基因表达已恢复到假手术组水平。这个结果提示，在SCI后早期Bax的改变可能不是造成细胞凋亡的主要原因。损伤后3d，Bax基因较1d显著性下降，这与之前的研究结果有差异［9］。造成差异的原因可能是损伤后模型不相同及普通RT-PCR与Realtime PCR在检测基因水平时的敏感性不一。

抗凋亡基因Bcl-2在SCI后整体呈现一个明显下降的趋势，这与之前的研究结果是一致的［10-11］。在假手术组，Bcl-2mRNA水平较高，在损伤后6h立即下降（P＜0．01），在12h的时候有明显的上升，这个结合Bax基因在SCI后的改变，提示在损伤后Bcl-2／Bax的比值改变可能是SCI后调控细胞凋亡的一个重要因素。Fan等［12］实验证明bcl-2和bax的表达强度直接或间接影响脊髓神经细胞的凋亡，且凋亡程度与其比值相关。林院等［13］研究发现，bcl-2／bax两蛋白之间的比例，是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。马利杰等［14］也通过对bcl-2，bax及其比值的变化与细胞凋亡检测结果相比较，发现bcl-2／bax值最小时是细胞凋亡发生的高峰，并且随着bcl-2／bax值的增大，凋亡的细胞在逐渐减少。综上，在SCI后bcl-2和bax的表达对神经细胞凋亡的调控有一定的影响，它们的比值直接关系到神经细胞凋亡发生的与否。MP是众所周知的目前对脊髓损伤的治疗唯一具有疗效的药物［15］，国外有学者证实MP疗法增强SCI功能恢复的机制之一为提高Bcl-2表达和抑制Bax表达［16］。郑世雄等［17］研究发现，在大鼠急性SCI早期，注射FTY720能够促进Bcl-2表达，抑制Bax表达，调高Bcl-2／Bax比值抑制神经细胞凋亡，并能减轻脊髓损伤程度，对脊髓神经有保护作用。综上结果说明，在脊髓损伤后，降低促凋亡基因Bax的表达，提高抗凋亡基因Bcl-2的表达，可以减轻脊髓继发性细胞凋亡损伤，从而促进损伤后神经功能的恢复。另外，本研究采用的是Real-time PCR的方法来检测脊髓钝挫伤后bax和bcl-2基因的表达改变，更为精准地展现了SCI后两个基因的一个表达变化趋势，为bax和bcl-2基因在脊髓钝挫伤后的作用机制的研究提供一定的依据。

［1］ Lee TT，Green BA．Advances in the management of acute spinal cord injury［J］．Orthop Clin North Am，2002，33（2）：311-315．

［2］ Beattie MS，Farooqui AA，Bresnahan JC．Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury［J］．J Neurotrauma，2000，17（10）：915-925．

［3］ 段有文，吕刚，吴海龙，等．Bcl-2和bax基因和细胞凋亡的关系及其在脊髓损伤中的作用［J］．中华麻醉学杂志，2005，10：97．

［4］ Lu J，A shwell KW，Waite P．Advances in secondary spinal cord injury：role of apoptosis［J］．Spine，2000，25（14）：1859-1866．

［5］ Seki T，Hida K，Tada M，et al．Role of the Bcl-2gene after contusive spinal cord injury in mice［J］．Neruosurgery，2003，53（1）：192-198．

［6］ 黄艳萍，王宇明．荧光定量PCR与普通PCR检测HBV DNA的对照分析［J］．第三军医大学学报，2001，2（8）：992-993．

［7］ Ginzinger DG．Gene quantification using real-time quantitative PCR：an emerging technology hits the mainstream ［J］．Exp Hematol，2002，30（6）：503-512．

［8］ Martin LJ，Liu Z．Injury-induced spinal motor neuron apoptosis is preceded by DNA single-strand Breaks and is p53-and Bax-dependent［J］．J NeuroBiol，2002，50（3）：181-197．

［9］ Amit D．Kandhare V．Shivakumar．Evaluation of the neuroprotective effect of chrysin via modulation of endogenous biomarkers in a rat model of spinal cord injury［J］．J N at Med，2014：68：586-603．

［10］ Kandhare AD，Shivakumar V，Rajmane A，et al．Evaluation of the neuroprotective effect of chrysin via modulation of endogenous biomarkers in a rat model of spinal cord injury［J］．J Nat Med，2014，68（3）：586-603．

［11］ Chen MH，Ren QX，Yang WF，et al．Influences of HIF-Iα on Bax／Bcle-2and VEGF expressions in rats with spinal cord injury［J］．Int J Clin Exp Pathol，2013，6（11）：2312-2322．

［12］ Fan L H，Wang K Z，Cheng B et al．Anti-apoptotic and neuroprotective effects of Tetramethylpyrazin following spinal cord ischemia in rabbits［J］．BMC Neurosci，2006，7：48．

［13］ 林院．Β-干扰素对SD大鼠急性脊髓损伤后Bax、Fas、Bcl-2基因逼到和细胞凋亡的影响［D］．福建医科大学，2010．

［14］ 马利杰，王红，王相利，等．大鼠急性脊髓损伤后神经细胞Bcl-2与Bax比值及细胞凋亡的关系［J］．第四军医大学学报，2005，26（22）：2042-2045．

［15］ Samantaray S，Smith JA，Das A，et al．Low dose estrogen prevents neuronal degeneration and microglial reactivity in an acute model of spinal cord injury：effect of dosing，route of administration，and therapy delay ［J］．Neurochem Res，2011，36（10）：1809-1816．

［16］ Kim YT，Caldwell JM，Bellamkonda RV．Nanoparticle mediated local delivery of methylprednisolone after spinal cord injury［J］．Biomaterials，2009，30（13）：2582-2590．

［17］ 郑世雄．FTY720对大鼠急性脊髓损伤后Bax及Bcl-2表达的影响［D］．福建医科大学，2011．