大鼠皮质受损区域Cdk5与细胞凋亡的相关性研究

蔡学坚王东军陈苑新魏长新黄剑

大鼠皮质受损区域Cdk5与细胞凋亡的相关性研究

蔡学坚①王东军②陈苑新①魏长新①黄剑①

目的：研究皮质受损区域细胞周期素依赖蛋白激酶5（Cyclin-dependent kinase 5，Cdk5）与细胞凋亡的关系。方法：采用Feeney’s自由落体模型制作大鼠颅脑损伤模型，随机分为2 h、1 d、3 d及7 d组，用免疫组化的方法检测创伤性脑损伤后受损脑皮质区域中Cdk5的表达情况；TUNEL方法检测该区域神经细胞的凋亡情况；WesternBlotting方法检测蛋白Cdk5时序表达水平变化的情况。结果：大鼠受损皮质区域Cdk5表达随时间增加而增加，7 d达到高峰；受损皮质区域凋亡阳性细胞变化趋势与Cdk5基本一致；细胞凋亡系数与Cdk5呈正相关性（r=0.88，P＜0.05）。对照组无明显变化。结论：大鼠皮质区域损伤可诱导Cdk5数量及激酶活性增加，从而参与神经细胞凋亡。

颅脑损伤； 细胞周期素依赖蛋白激酶5； 细胞凋亡

Cdk5为丝/苏氨酸胞周期素依赖蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，Cdk）家族一类成员，存在于神经系统中，含292个氨基酸残基，相对分子质量为33×103，激活后可磷酸化不同的相关底物。到目前为止鉴定出的Cdk5底物约有20余种，包括蛋白激酶K、Tau蛋白、神经丝蛋白及β-连环蛋白等[1-5]。近年来，在脑缺血再灌注损伤研究中发现Cdk5是神经细胞凋亡过程中重要的上游因子[6-7]。然而，到目前为止关于Cdk5与细胞凋亡的相关性在大鼠损伤模型中国内外鲜有报道，因此阐明颅脑损伤后Cdk5与细胞凋亡的相关性，对临床寻找新的治疗靶点有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂 免疫组化染色试剂盒：北京中杉金桥生物公司。Anti -Cdk5：货号bs-1090R，北京博奥森。DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物公司。PVDF膜（0.22um）品牌pall：广州誉维生物科技仪器有限公司。TUNEL凋亡检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验动物及分组 将大鼠48只（雄性，体重180～220 g，来源于南方医科大学实验动物中心）随机分为两组，即造模组（颅脑损伤组）和对照组（空白组）各24只，各组再随机均分为4个小组（n=6）；各小组时间点确定在损伤后2 h、1 d、3 d及7 d（以缝合头皮结束开始计时为0时）。实验过程中不符合实验要求的大鼠予以相应替换。

1.3 大鼠颅脑损伤模型的制作方法 造模组采用Feeney’s自由落体模型制作大鼠颅脑损伤模型（Trauma Brain injure，TBI）。大鼠麻醉成功后固定，在无菌条件下操作，选取左顶部前囟点和人字点中间偏离正中线约3.5 mm处纵形切开头皮，持牙科钻去除骨瓣，大小约0.6 cm×0.6 cm，注意勿损伤硬脑膜。安装自由落体撞击装置，撞击点设为左侧顶叶皮层，祛码重量为20 g，撞击高度为30 cm，撞击力为600 g·cm，制造中度颅脑损伤模型。撞击后行伤口及板障止血后缝合头皮。对照组仅切开头皮打开骨窗并行伤口板障止血后即缝合头皮。大鼠处死前行大鼠神经运动功能评分。

1.4 标本的处理及切片的制备 用3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后打开胸腔，用PBS缓冲液经左心室灌注，打开右心耳至留出清亮液体，再用4%多聚甲醛PBS缓冲液10～15 d/min灌注，处死动物并固定60 min后断头。在冰盒上快速开颅取脑，切取左侧损伤侧大脑，再以损伤灶为中心冠状面水平切取左侧大脑为前后两半，一半行切片免疫组化检查，另一半行Western Blotting蛋白检测。行切片免疫组化检查的受损区域脑组织用石蜡包埋，然后以冠状位由损伤皮质区中心向后连续切片，切片厚约5 μm。另外一半行Western Blotting蛋白检测的脑组织行受损区

域脑皮质分离，在冰盒上操作，剥离硬脑膜，用小镊子从切面处将脑皮质向外侧分离，完整分离出脑皮质，放入冻存管，做好标记，保存于-80 ℃液氮瓶里。

1.5 免疫组织化学染色 石蜡切片行免疫组化染色，方法为兔超敏二步法，切片用3%的H2O2封闭10 min后，用pH=6.0的枸橘酸溶液加热孵育15 min行抗原修复。冷却至室温后用5%山羊清室温封闭20 min。滴加Cdk5一抗4 ℃过夜。PBS清洗后依次滴加试剂1和试剂2室温孵育20 min。DAB显色剂显色，冲洗，苏木素复染，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。Cdk5的表达均以细胞浆和胞膜内侧出现黄色或棕黄色着色为阳性。

1.6 Western Blotting蛋白检测 蛋白提取试剂盒提取冰冻脑皮质组织（约80mg）总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，蛋白浓度定量到每孔60 μg。依次加入5 x上样缓冲液煮沸（94 ℃，10 min）、上样（每孔30 μL）、电泳、转膜、封闭；Cdk5一抗（比例1：300）4 ℃冰箱孵育过夜16 h，TBST洗膜5 min×5次，滴加山羊抗兔二抗（比例1∶6000），常温摇床1 h，TBST洗膜5 min×5次，ECL发光显色，胶片曝光，扫入凝胶成像系统进行灰度比值分析。

1.7 TUNEL法检测细胞凋亡 组织切片入新鲜配制的4%多聚甲醛室温固定30 min；PBS洗3次，5 min/次；入3%过氧化氢溶液甲醇中30 min以封闭内源过氧化物酶；入0.1%Triton X-100枸橼酸钠缓冲液中冰浴2 min；PBS洗涤3次；加TUNEL反应混合液37 ℃反应1～1.5 h；PBS冲洗3次；加POD反应液37 ℃ 30 min；PBS冲洗3次；DAB显色5～10 min；苏木精复染核，脱水，透明，封片，镜检。染色结果判定：结果判定以胞核、胞质中有棕黄色或者棕褐色颗粒者为阳性细胞。计算神经细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料用（±s）表示，两样本均数间比较采用t检验（t-test）；双变量关联性分析采用直线相关方法分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠颅脑损伤模型结果的观察 48只大鼠实验过程中发现，除对照组24只外，造模组24只大鼠均出现不同程度神经功能缺损症状体征，表现为不同程度的肢体功能瘫痪，出现意识障碍的有4只。开颅取出大脑后见撞击点出现脑挫裂伤灶（见图1）。参照Longa等[8]大鼠神经功能缺损评分方法，选取评分为1～3分的动物损伤模型组及参照组。

图1 大鼠TBI模型的整体观

2.2 免疫组化染色 损伤侧Cdk5阳性细胞随着时间的增加而增多，损伤后2 h、1 d、3 d及7 d时间点各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；而对照组各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图2、图3。

表1 造模组和对照组大鼠脑皮质区Cdk5的免疫组化实验iOD值（累计光密度）（x-±s）

2.3 TUNEL法检测 损伤侧TUNEL阳性细胞随着时间的增加而增多，损伤后2 h或1 d与3 d及7 d时间点各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而2 h与1 d两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而对照组各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图4、图5。

2.4 相关性统计分析 造模组免疫组化染色及TUNEL检测结果的直线相关性分析显示：Cdk5的表达水平与细胞凋亡系数AI%存在正相关性，Pearson积距相关系数r=0.88，P＜0.05。见图6。

图2 造模组和对照组大鼠脑皮质区Cdk5的免疫组化实验iOD值比较

2.5 Western blot 定量分析损伤不同时间点Cdk5的表达。随着时间的增加，造模组的Cdk5表达量增加。见图7。

表2 大鼠脑皮质区TUNEL细胞凋亡AI%

3 讨论

图3 大鼠皮质受损区域Cdk5免疫组化图

图4 大鼠脑皮质区TUNEL细胞凋亡AI%时序图

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理情况下，在自身基因调控下按照自身的程序出现的主动死亡过程，与细胞坏死不同，由Kerr等[9]在1972年提出。1995年Rink等[10]发现在颅脑损伤模型大鼠的脑皮质等大脑区域均出现凋亡的神经细胞，从而证实创伤性脑损伤后存在细胞凋亡。在TBI后几小时至数周内，大脑皮质、海马和纹状体等中枢神经系统一般都有神经元的丢失和损伤，其中常见的病理改变为核浓缩及皱缩[11]。

图5 大鼠皮质受损区域TUNEL图

图6 造模组Cdk5蛋白的iOD值与细胞凋亡AI指数的相关性线图

图7 造模组4个时间点Cdk5的WB结果

越来越多的实验证明，Cdk5与神经细胞凋亡的关系更加密切，它是神经细胞凋亡的重要上游因子[7]。研究发现，小鼠短暂性脑缺血后，Cdk5活性和P25表达增加与海马CAl区的神经细胞凋亡有关[12]。Sakaue等[13]应用二甲基汞诱导大鼠小脑颗粒培养细胞死亡，

证实低浓度二甲基汞可导致胞内Ca2+内流增多，使胞内calpain激活，将p35裂解成p25，形成P25-Cdk5复合体，从而使神经细胞凋亡。可见，调控Cdk5活性对神经细胞凋亡的影响已成为研究的热点。

Cdk5特定调节因子为分子量为34.8 kD的非周期素蛋白P35，其特异地存在于中枢神经系统中。P35主要存在于大脑皮质，并存在于细胞膜组分中。P35为不稳定蛋白质，半衰期只有20～30 min，泛素化后被激活的蛋白酶裂解而失活。在兴奋性氨基酸及自由基等刺激下，被钙激活蛋白酶（Calpain）裂解成P25和另一10 kD片段[14]，P25半衰期比P35长5～10倍，具备完全激活Cdk5的功能，且激活能力更强，可造成Cdk5不可调控性激活[14-15]。颅脑损伤后，被激活的Cdk5可结合多种细胞凋亡相关底物，启动不同的凋亡途径，引起神经细胞凋亡。

本研究表明大鼠皮质区域损伤后，Cdk5的活性表达与神经细胞凋亡呈正相关性。通过免疫组化及免疫印迹法笔者观察到大鼠皮质区域损伤后2 h即有Cdk5表达增加，与此同时通过TUNEL法亦观察到在2 h组即有凋亡细胞出现；随后从2 h～1 d时间段Cdk5活性及凋亡细胞的数量均呈现平缓上升；2 d开始Cdk5表达活性急剧上升，脑细胞损伤也呈现迅速扩大趋势，表现为凋亡细胞数量急剧增加，1 d组可称为脑损伤后的一个“拐点”；其后两者逐渐上升，于7 d达到观察范围内的高峰。这与通过时间-量变分析表明Cdk5与凋亡细胞之间有高度相关性的研究相符合[16]。结果提示，颅脑损伤后2 h之前可能是颅脑损伤诱发各种损伤因子形成初级阶段，是引发进一步脑损伤的重要拐点；因此进一步研究由Cdk5引导的颅脑损伤后神经细胞凋亡新途径有可能找到新的治疗靶点及有效时间窗。

总之，颅脑损伤后Cdk5与神经细胞凋亡密切相关，为颅脑损伤的临床治疗提供新的实验依据。如果能够寻找到Cdk5特异性抑制剂，抑制其活性，对于进一步探讨Cdk5与细胞凋亡的关系和寻找颅脑损伤新的治疗方法具有重要的意义。

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10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.006

2014-11-11） （本文编辑：陈丹云）

①广东省东莞市大岭山医院 广东 东莞 523819

②广东医学院

王东军