传统奶酪样品中乳酸菌的分离鉴定

杨彦荣,任艳,德亮亮,陈红霞,张冬蕾,刘文俊,张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

0 引言

传统发酵奶制品的制作与食用已有数千年的历史，生产和消费群体遍布世界各地[1]。其中奶酪又是乳中的精品，被誉为“乳业皇冠上的珍珠”。

大量的研究表明，以牛奶为原料通过传统发酵方法生产的新鲜奶酪制品中包含着丰富的微生物群落，微生物的组成是影响奶酪质量的关键因素[2，3]。然而，有关俄罗斯地区传统发酵乳制品中乳酸菌的研究还相对较少，对其中微生物特别是乳酸菌的研究还不够深入。

本研究以实验室纯培养的方法，和16S rRNA基因序列分析方法对俄罗斯卡尔梅克地区奶酪的乳酸菌进行分离鉴定，以期为传统乳制品的品质改良和优良发酵剂菌种的筛选提供基础知识和珍贵的乳酸菌资源。

1 引言

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本研究的7份传统发酵奶酪样品是由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室的研究人员于2012年8月～9月于俄罗斯卡尔梅克共和国地区采集的。

1.1.2 培养基与试剂

培养基：MRS固体培养基BD（DifocTMLactobacilli MRS Agar），MRS液体培养基（OXOID），M17液体培养基（OXOID），M17液体培养基加1.5%琼脂为M17固体培养基，M17培养基中添加2%葡萄糖和0.5%乳糖。

PBS：0.8%氯化钠，0.02%磷酸二氢钾，0.115%磷酸氢二钠。

脱脂乳保护剂：10 g脱脂乳粉，0.1 g谷氨酸钠，蒸馏水 90 mL（121℃，7 min灭菌，98℃急冷）。

提取DNA所用试剂：0.5 M EDTA，10%SDS，10 mol/L CTAB，TE缓冲液（pH8.0），酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1，体积比），氯仿/异戊醇（24∶1，体积比），浓度为5 mol/L的NaCl，3 mol/L的NaAc，异丙醇，乙醇，蛋白酶K（Proteinase K）、核糖核酸酶A（RnaseA）。

PCR扩增和电泳检测所用试剂：Easy Taq DNA聚合酶、10×Easy Taq PCR缓冲液（Mg2+）、高纯度dNTPs（每种2.5 mmol/L）、5×TBE电泳缓冲液贮液、0.8%～1.2%的琼脂糖凝胶、核酸染料GELVIEW（北京百泰克）、λ DNA/Hind III Marker和QDL2,000 Quantitative DNA Marker。以上配制试剂所用的化学药品均为天津市北方天医化学试剂公司的产品，为分析纯。上述酶类和Marker均购自北京全式金生物技术有限公司和大连宝生物技术有限公司（TaKaRa）。由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

1.1.3 设备

JT102N电子天平，HIRAYAMA HA-300M全自动高压蒸汽灭菌器，ADVANTEC SP-650全自动高压干热灭菌器，ZHJH-C1214C双人双面超净工作台，OLYMPUS BX50光学显微镜及OLYMPUS PM-2摄像系统，LABC0NC0LL-6SFPY真空冷冻干燥机，EYELA WFO-400浓缩干燥系统，MIR-1620型电热恒温培养箱，ZHWY-200D型水平摇床，HHS 1-Ni电热恒温水浴锅，Eppendorf TGL-168高速台式离心机，Eppendorf 5810高速冷冻离心机，MJ RESEARCH PTC-200梯度基因扩增仪，DYY-12电泳仪，UVPGDS-8000凝胶成像仪，ND-1000型微量紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

本研究在采集样品时直接用无菌勺取5.0 g左右样品放入装有0.5 g灭菌中和剂（淀粉/CaCO3，50∶1，质量比）的无菌螺口冻存管中，混匀后用封口膜封口后标记样品号。将采集的所有样品放入4℃便携式冰箱内保持低温度状态，带回实验室后，尽快进行微生物组成分析和乳酸菌的分离实验。

1.2.2 乳酸菌的组成分析、分离纯化与保存

乳酸菌计数：采用倾注法。将样品用漩涡振荡器混匀，用质量分数为0.85%的无菌生理盐水以10倍稀释法对样品进行梯度稀释，分别选取稀释度为10-5，10-6，10-7的稀释液1 mL于无菌培养皿中，与MRS和M17平板计数培养基混匀，置于30℃恒温培养箱中倒置厌氧培养48 h。然后计数即为每毫升样品的菌落数[4]。

将上述梯度为10-4，10-5，10-6的稀释液分别涂布于含有0.01%（体积份数）放线菌酮的无菌MRS和M17固体培养基上，30厌氧培养48 h，挑取形态学特征不同的单个菌落于相应的液体培养基中，30℃培养24 h。选取过氧化氢阴性、革兰氏阳性的纯培养物，加入含质量分数为0.1%谷氨酸钠的脱脂乳保护剂，分装于无菌安瓿管中和冻存管中于-80℃保存，备用[5]。

1.2.3 乳酸菌鉴定

（1）基因组DNA提取与纯度检测。纯化好的菌株用CTAB法和冻融法相结合提取基因组DNA[6-7]。使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度。

（2）16S rRNA基因的PCR扩增。PCR扩增16S rRNA引物采用通用引物，正向引物为FA-27F（GCAGAGTTCTCGGAGTCA CGAAGAGTTTGAT CCTGGCTCAG）；反向引物为 RA-1495R（AGCGGATCACTTC ACACAGGACTACGGCTACCTTGT TACGA）[8]。由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR扩增片段约为1 450 bp。取2 μL产物用质量浓度为0.1 g/dL琼脂糖凝胶电泳检测。

16S rRNA基因的PCR扩增体系：5 μ L 10×Easy Taq Buffer（+Mg2+）；4 μ L High Pure dNTPs（浓 度 2.5 mmol/L）；1.5 μL引物FA-27F（浓度10 mmol/L）；1.5 μ L引物 RA-1495R（浓度 10 mmol/L）；0.5 μLEasyTaq DNA polymerase（5U/μL）；2 μLDNA模板（质量浓度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

16S rRNA基因的PCR扩增循环参数为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72 ℃末端延伸10 min[9]。

扩增反应完毕后，取约2 μL的PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，若在1 500 bp处有清晰的扩增条带且无拖尾、弥散现象，则PCR扩增成功。

（3）16S rRNA序列测定和构建系统发育树。将检测后片段长度约为1500 bp的阳性产物直接送上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定。采用DNAStar 5.01软件中的SepMan模块，对所测得菌株的两条16S rRNA基因序列进行整理、拼接、校准，得到1 450 bp左右的有效序列，于NCBI数据库中利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具与GenBank数据库中已知菌株的16S rRNA基因序列进行比对鉴定[10]，寻找同源性最高的已知分类学地位的菌种。

利用软件Mega5中的Neighbor-joining法对37株乳酸菌作系统进化树,比较了它们之间的进化距离[5，11]。

3 结果与讨论

3.1 乳酸菌的计数

俄罗斯地区样品中乳酸菌的计数结果如表1所示。

表1 俄罗斯卡尔梅开共和国传统发酵奶酪样品中乳酸菌计数结果（n=3，±SD）

表1 俄罗斯卡尔梅开共和国传统发酵奶酪样品中乳酸菌计数结果（n=3，±SD）

样品编号Ru 4 Ru 5 Ru 6 Ru 24 Ru 26 Ru 30 Ru 39采样地俄罗斯卡尔梅克共国亚什库尔镇亚什库尔镇亚什库尔镇亚什库尔镇嘎西贡亚什库尔镇嘎西贡伊科朝纳斯沃兹涅谢诺夫卡乳酸菌数（对数值）/mL-1 8.92±0.01 7.50±0.23 8.19±0.03 7.16±0.01 6.64±0.02 9.05±0.03 8.43±0.02

由表1可以看出，奶酪样品中乳酸菌数为6.64～9.05 mL-1，平均值为（7.98±0.91）mL-1。研究结果和Bao Qiuhua对甘肃牦牛乳曲拉和四川曲拉的研究结果相近。其平均乳酸菌数分别为（7.9±0.89）mL-1[12]和（7.18±1.49）mL-1[4]。曲拉又称粗奶酪，与奶酪生产工艺相似。

3.2 乳酸菌的鉴定

3.2.1 菌种DNA提取和16S rRNA扩增

DNA浓度和OD260/280的测定：OD260/280值在1.8～2.0间即为纯DNA样品。将其质量浓度稀释至100 ng/μL后进行16S rRNA基因扩增。

对乳酸菌分离株16S rRNA基因进行扩增。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，可以观察到在大约1 500 bp的位置处有一条清晰明亮的条带，并且无弥散现象，无明显非特异扩增现象。

这表明菌株的16S rRNA基因扩增产物可以满足测序的要求。将16S rRNA基因扩增产物送于上海美吉生物科技有限公司进行测序。所有的16S rDNA序列都与GenBank数据库中的标准菌株有99%及以上的相似度，根据前人的研究，16S rRNA用于鉴定乳酸菌有很高的可靠性。

3.2.2 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定

将测序获得的16S rRNA基因序列通过NCBI数据库中BLAST进行同源序列比对分析，以与模式菌株序列同源性大于98%为种的鉴定阈值，将17株分离株鉴定为乳酸菌的3个属，20个种。分离株与模式株系统发育树如图1所示。

由图1可以看出，菌株IMAU90028，IMAU90029，IMAU90030，IMAU90032，IMAU90034，IMAU90046，IMAU90048，IMAU90065，IMAU90088，IMAU90150，IMAU90209与标准菌株 Lactobacillusplantarum ATCC14917聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus plantarum。菌株IMAU90033、IMAU9 0066与标准菌株Lactobacillus brevis ATCC14869聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus brevis。菌株IMAU90215与标准菌株Lactobacillus kefiri LMG9480聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus kefiri。菌株IMAU90047与标准菌株Lactobacillus graminis DSM20719聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus graminis。菌株IMAU90086，IMAU90087，IMAU90091，IMAU90094，IMAU90210，IMAU90214与标准菌株Lactobacillus paracasei ATCC25302聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴 定 为 Lactobacillus paracasei。 菌 株 IMAU90176、IMAU90174与标准菌株Enterococcusdurans ATCC19432聚为一类，且同源性为70%，故将其鉴定为Enterococcus durans。菌株IMAU90155、IMAU9015 6、IMAU90157、IMAU90158、IMAU90212、IMAU9021 3与标准菌株Enterococcus faecium ATCC 19434聚为一类，且同源性为99%，故将其鉴定为Enterococcus faecium。 菌 株 IMAU90067，IMAU90090，IMAU90092，IMAU90093，IMAU90151，IMAU90211与标准菌株Lactobacillus helveticus DSM20075聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus helveticus。菌株IMAU90177与标准菌株Leuconostoccitreum ATCC49370聚为一类，且同源性为100%，故将其鉴定为Leuconostoc citreum。菌株IMAU90178与标准菌株Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC1777聚为一类，且同源性为69%，故将其鉴定为Leuconostoc pseudomesenteroides。

图1 分离株与其相应模式株16S rRNA系统发育树

所有分离株鉴定结果和种属统如表2所示：

本研究的奶酪样品中乳酸菌的优势菌群为Lactobacillus plantarum（29.7%），其次分离株数较多的是Lactobacillus paracasei（16.2%）、Lactobacillus helveticus（16.2%）、Enterococcus faecium（16.2%）。不同地区的奶酪样品中优势菌群是不同的：Aydemir等所研究的奶酪中优势菌为Lactobacillus casei和Lactobacillus plantarum[13]；Dolci等的研究中Lactobacillus plantarum和Lactobacillus paracasei是Castelmagno PDO奶酪中的优势菌[14]；Coppola R等的研究中Caciocavallo奶酪的优势菌为Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei、Lb.pentosus,Lb.coryneformis subsp.Torquens和 Lb.plantarum.[15]；Coppola S等的研究中Mozzarella奶酪的优势菌为Strep.thermophilus[16]；还有的为 Lactobacillus paracasei、Lactobacillus fermentum和Lactobacillus plantarum[17]。不同环境自然发酵的奶酪中优势菌群是不同的，我们所分离到的Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei在奶酪中也是比较常见的。

表2 乳酸菌分离株与模式菌株同源性比对结果

4 结论

7份奶酪样品中乳酸菌数为6.64～9.05 mL-1（对数值），乳酸菌含量都比较高。7份奶酪样品中共分出37株菌，分别属于肠球菌属、乳杆菌属、明串株菌属，共3个属10个种。乳球菌10株，乳杆菌27株。本研究可以为俄罗斯卡尔梅克地区传统奶酪中乳酸菌多样性研究提供原始数据，也可以为以后的乳酸菌筛选与工业生产提供菌株资源。

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