直接酶解技术制备水牛乳抗氧化肽基料

李玲，唐艳，黄丽，杨攀，农皓如，冯玲，曾庆坤

（中国农业科学院广西水牛研究所，南宁530001）

0 引言

目前已经从乳蛋白酶解物中分离得到多个具有抗氧化活性的肽段，这些肽段的分子量多＜3 000 u[1-4]。水牛乳与普通牛乳蛋白存在差异[5]，不同乳源蛋白的氨基酸序列不同，存在氨基酸变异现象[6]，水牛乳蛋白质本身也存在多态性[7]-[8]，蛋白多态性影响氨基酸序列，最终可能影响酶解肽的功能活性[9]，有必要对水牛乳蛋白抗氧化活性肽进行研究与开发。在前期水牛乳酪蛋白酶解工艺研究中，发现碱性蛋白酶的酶解能力以及酶解产物的DPPH自由基清除能力最强[10]，酶解液的苦涩味最低（极微）。但碱性蛋白酶在酶解过程中，需要调节pH值至10.5，引入的盐分较多，碱味过重，色泽偏黄或棕色，其制备的多肽基料必须进行脱盐、脱色以及风味掩盖，才能应用于含肽食品生产。为此，本文在此基础上，拟通过直接酶解技术，研发1种感官良好，无需额外脱盐、脱色工艺，可直接添加应用的水牛乳抗氧化多肽基料。

1 实验

1.1 材料

生水牛乳，碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，Protamex蛋白酶，风味蛋白酶，DPPH（Sigma-Aldrich），盐酸与氢氧化钠为食品级，其余试剂均为分析纯。

8400自动凯氏定氮仪，离心机，紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 工艺路线

水牛乳→调节蛋白质质量分数（无需进行乳清和酪蛋白分离）→杀菌、恒温、调整pH值→添加酶进行酶解→[持续滴加NaOH，调节pH值]→灭酶→冷却酶解液→得到水牛乳多肽基料。

1.2.2 感官评价

产品感官评分主要根据酶解液的色泽、滋味、组织状态等进行综合评价。其中色泽20分，滋味50分，组织状态30分，评分细则如表1所示。

清除DPPH自由基的能力参考李玲等[10]方法，前处理方法改进为：将酶解液离心脱脂、去沉淀后，取清液，定容后进行测定。水解度的计算采用pH-Stat[11]滴定法。酸溶性蛋白测定采用15%TCA-SN法。

1.2.3 酶解实验设计

表1 感官评分细则

采用单因素以及正交实验对蛋白酶、加酶量、酶解时间、酶解pH值等酶解条件进行优化。正交实验因素水平表如表2所示。

表2 L9(34)正交实验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素实验对酶解条件的优化

2.1.1 蛋白酶对酶解的影响

在各蛋白酶的最适pH值条件下（见表3），进行酶解，选择最适的蛋白酶。酶的选择对酶解液的影响如表4以及图1～图3所示。风味蛋白酶含有外切酶，常与其他蛋白酶复配用于多肽的制备，以降低酶解产物的苦味[12]，本文单独采用风味蛋白酶制备的酶解液，无苦涩味，水解度高，色泽较碱性蛋白酶解液浅，DPPH自由基清除率已接近碱性蛋白酶和Protamex蛋白酶酶解液，是制作直接酶解液多肽基料的优良蛋白酶。

表3 各蛋白酶的最适酶解pH值

图1 不同蛋白酶对水解度的影响

图2 不同蛋白酶对色泽降低值的影响

图3 不同蛋白酶对酶解液DPPH自由基清除率的影响

表4 不同蛋白酶得到的酶解液的感官评价 分

2.1.2 加酶量与酶解时间对酶解的影响

选择加酶量 1 250（F-1），2 500（F-2），5 000（F-3），10 000 U/g（F-4）；评价各加酶量条件下30，60，90，120 min时各酶解液的色泽、滋味等感官，测定其蛋白水解度以及酶解液的DPPH自由基清除率，结果如图4～图8所示。

图4 加酶量及酶解时间对酶解液色泽的影响

图5 加酶量及酶解时间对酶解液滋味的影响

图6 加酶量及酶解时间对酶解液感官评分的影响

图7 加酶量及酶解时间对酶解液DPPH清除率的影响

随着加酶量的增加，酶解液的色泽逐渐加深，由乳白色变为乳黄色至浅黄色。加酶量为1 250 U/g底物时，滋味评分最低，存在一定的苦涩味，加酶量大于2 500 U/g底物以后，苦涩味随着酶解时间的延长，逐渐降低甚至消失，但当加酶量10 000 U/g底物酶解90 min以后，酶解液中出现一定的咸味、碱味等不良风味，总体来说，5 000 U/g底物在不同酶解时间的感官最好。且5 000 U/g底物下制备的酶解液，在酶解60 min以后均具备较高的DPPH自由基清除率，加酶量10 000 U/g底物酶解液虽然水解度最高，但可能因酶解过度，DPPH自由基清除率反而下降。综合评价后，确定加酶量在5 000 U/g底物附近，酶解时间60～120 min。

图8 加酶量及酶解时间对酶解液蛋白水解度的影响

2.1.3 pH值对酶解的影响

在加酶量5 000 U/g底物、反应时间60 min下，对最适的酶解pH条件进行优化，结果如图9～图11所示。pH值在6～7之间，酶解液的DPPH自由基清除率以及感官评价差异不大，但pH＞7.5以后，均略有降低。由于pH-Stat水解度的测定方法仅限于初始pH＞7.0的反应，因此本单因素采用酸溶性蛋白质量分数（15%TCA-SN）评价其蛋白的水解度，结果发现，pH值在7.0附近，其酶解液中酸溶性蛋白质质量分数最高，为3.85%，占总蛋白的93.03%。因此，确定pH值7.0为最适的酶解条件。

图9 pH值对酶解液感官的影响

图10 pH值对酶解液DPPH自由基清除率的影响

图11 pH值对蛋白水解度的影响

2.1.4 pH值在线调控与否对酶解的影响

在线调控pH值，会在酶解过程中引入更多的氢氧化钠，酶解液咸味、碱味增加，其功能活性可能会降低[13]。为此，分析了酶解过程中在线滴定调节pH值与否对酶解液的影响，控制加酶量5 000 U/g底物、反应时间60 min，结果如表5所示。由表5可以看出，不调控pH值，虽然其酶解产物的水解度稍低，但DPPH清除率、色差、感官、酸溶性蛋白含量与在线调控pH值的产物无显著差异（P＞0.05）。不维持pH值，可以避免过多盐分的引入，降低咸味、碱味，因此在后续的优化过程中，维持初始pH值7.0后，选择不再调节pH值。

表5 pH值在线调控与否对酶解液的影响

2.2 正交实验对酶解条件的优化

在单因素试验基础上，在风味蛋白酶的最适温度50～60℃范围内，进一步通过正交实验优化酶解工艺，因正交实验酶解原液的DPPH自由基清除率均较高，均能达到90%以上，此处采用IC50值来对比其自由基清除能力。正交实验结果分析如表6所示。

由表6可以看出，极差分析显示对水解度的影响主次因素为A＞B＞C，影响DPPH自由基清除率的主次因素为A＞B＞C，影响感官评价的主次因素为A＞C＞B，方差分析表明（字母不同代表存在显著差异P＜0.05），加酶量对DPPH自由基清除率和感官评分存在显著差异，当加酶量＞5 000 U/g底物时，其DPPH自由基清除率显著高于加酶量3 000 U/g底物，但当加酶量＜5 000 U/g底物时，酶解液的感官评分更高。综合考虑后，选择A2B2C3，即加酶量5 000 U/g底物时，酶解时间90 min，酶解温度60℃为最佳酶解条件。

2.3 验证实验

对最优工艺A2B2C3，进行6次平行实验，测定感官、DPPH自由基清除率、蛋白水解率等各指标。结果如表7所示。

由表7可以看出，验证实验得到的酶解液水解度22.28%，终点pH值为6.13，酸溶性蛋白率（15%TCA-SN）达到95.71%，感官评分达到85.6分，DPPH自由基清除IC50值为0.071±0.008 mL，色泽乳白至乳黄，无异味，含极微的咸味。

表6 L9(34)正交实验结果

表7 验证实验酶解液的各指标测定值

3 结论

风味蛋白酶是直接酶解技术制备水牛乳抗氧化活性肽基料的绝佳蛋白酶，通过控制加酶量5 000 U/g底物，酶解时间90 min，酶解温度60℃，过程中不调控pH值，得到的水牛乳液态抗氧化多肽基料，酸溶性蛋白率（15%TCA-SN）达到95.71%，DPPH自由基清除IC50值为（0.071±0.008）mL，基料的色泽乳白至乳黄、无苦味、无涩味、无碱味、含极微的咸味，应用前无需进行脱色、脱苦、脱盐处理，可直接在含肽食品中添加应用。

[1]SUETSUNA K,UKEDA H,OCHI H.Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein[J]Nu⁃tr Biochem,2000,11(3):128-131.

[2]RIVAL S,BOERIU C,WICHERS H J.Caseins and casein hydro⁃ly-sates.2.Antioxidative properties and relevance to lipoxygenase in⁃hibition[J].J Agric Food Chem,2001,49(1):295-302.

[3]CONTRERAS M M,HERNA LEDESMA B,AMIGO L,et al.Pro⁃duction of antioxidant hydrolyzates from a whey protein concentrate with thermolysin:optimization by response.surface methodology[J].LWT Food Sci Technol,2011,44(1):9-15.

[4]刘志东，郭本恒，王荫榆，等.乳抗氧化肽的分离纯化与结构鉴定[J].天然产物研究与开发，2010,22:740-746.

[5]曾庆坤，杨炳壮，任发政,等.水牛乳蛋白质的组成[J].中国乳品工业，2007,135（8）：31-33.

[6]徐明芳，戴金风，向明霞.基于LTQ-Orbitrap液相色谱-质谱联用技术的乳源乳清蛋白组分的差异性研究[J].分析化学,2014,42(4):501-506.

[7]LIN B,REN D,LI L,et al.Effects of kappa-casein variants on buffalo milk protein processing properties and Mozzarella cheese quality[J].Journal of Food,Agriculture&Environment,2013,11(3-4):549-555.

[8]任大喜,陈有亮,刘建新,等.焦磷酸测序法分析中国荷斯坦牛、娟姗牛及水牛的乳蛋白基因多态性[J].食品质量安全检测学报，2014,5(10):1-7.

[9]LISSON M,LOCHNIT G,ERHARDT G.Genetic vatiants of bov⁃ing β-and k-casein result in different immunoglobulin E-binding epitopes after in vitro gastrointestinal digeation[J].Dairy Sci.，2013,96:5532-5543.

[10]李玲，唐艳，农皓如，等.碱性蛋白酶制备水牛乳抗氧化活性肽酶解条件的优化[J].中国乳品工业，2011,39（253）：12-14.

[11]MIRQUEZ M C,FERUNDEZ V.pH-Stat Method to Evaluate the Heat Inactivation of Subtilis Inhibitor in Legumes[J].Chem.Bio⁃chem Eng.，2002,16(1):31-35.

[12]何光华,尤玉如,储小军,等.乳清蛋白肽苦味修饰及其发酵饮料的研究[J].中国乳品工业,2008,36(11):29-32.

[13]杨磊.螺旋藻活性肽的制备及其免疫调节功能研究[D].广西大学,2009:21-23.