平菇各生长期菌质中低聚木糖的提取工艺研究

吕文亭， 于明鹤， 王国辉

（1.河北北方学院动物科技学院，河北张家口 075131；2.文安县畜牧兽医局，河北廊坊 065800）

平菇菌质是以稻草、棉籽壳、玉米芯等农业副产品为主要原料栽培平菇后的剩余培养基 （许艳丽等，2015）。我国平菇栽培极为广泛，平菇菌质资源丰富，却未得到有效利用（宫福臣等，2012）。低聚木糖 （XOs）是一种新型的功能性低聚糖添加剂，具有促进肠道有益菌增殖、抑制有害菌生长、提高动物生产性能和机体免疫力等独特的生理功能（孙罗美等，2012）。研究表明，食用真菌能在生长繁殖过程中，产生大量的胞内酶和胞外酶，将稻草等培养基中的纤维素、半纤维素、木质素等高分子物质降解成单糖、双糖及低聚糖等低分子物质，使培养基中的营养成分含量大幅度提高 （岳新叶等，2005）。本试验以各生长时期的平菇菌质为原料，以菌质的颗粒细度、浸泡时间、浸煮时间和处理液的pH值为影响因素，采用L9（34）正交试验设计，筛选出平菇菌质中XOs的最佳提取工艺，为增加平菇菌质的附加值，实现平菇菌质的推广和XOs产品的低成本应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要设备 各生长时期平菇菌质，由河北北方学院农林科技学院提供。

95%低聚木糖（XOs）标准品（山东龙力生物科技有限公司）；3，5-二硝基水杨酸 （化学纯）；NaOH、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、盐酸和NaHCO3均为分析纯。

101C-2型电热鼓风干燥箱 （上海实验仪器厂）、UV755B型紫外可见分光光度计 （上海分析仪器总厂）、SHA-C型水浴恒温振荡器（江苏金坛中大仪器厂）、LD4-2型低速离心机 （北京医用离心机厂）、调节式万用电炉（上海华联环境试验设备公司恒昌仪器厂）、DS-1型高速组织捣碎机（上海标本模型厂）、6511型电动搅拌机（上海标本模型厂）、JY3002型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、FA1104型上皿电子天平（上海天平仪器厂）、JZ7114单相感应电动机（上海微型电机厂）、pHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 10 mg/mL XOs标准液的制备 准确称取干燥至恒重的95%XOs标准品1052.632 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，冰箱中保存备用。

1.2.2 3，5-二硝基水杨酸试剂的制备 6.3 g 3，5-二硝基水杨酸和262 mL 2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中备用。

1.2.3 XOs标准曲线的绘制 按表1要求取24支具有25 mL刻度的试管分成3组，分别加入不同剂量10 mg/mL XOs标准液和蒸馏水，最后每个试管加入3，5-二硝基水杨酸试剂1.5 mL，将各管摇匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25 mL刻度处，摇匀。将第一个试管样品作为空白对照，在波长540 nm处测定吸光度值。以XOs浓度（C）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制 XOs标准曲线，得回归方程：Y=0.2843C+0.0065，R2=0.9999。

表1 XOs标准曲线的绘制

1.2.4 正交试验设计 选取平菇菌质的颗粒细度（A）、浸泡时间（B）、浸煮时间（C）和处理液的 pH值（D）4 个因素，采用 L9（34）正交设计，进行 4 因素3水平试验 （表2），根据所测定平菇菌质中XOs的含量确定最佳提取工艺条件。

表2 正交试验因素与水平

1.2.5 待测样品液的制备 平菇菌质→烘干→粉碎→浸泡→浸煮→抽提→浓缩→定容→平菇菌质待测样品液。

具体步骤：在平菇菌丝降解稻草过程中，分别采集各个生长时期的菌质样品，将其剪成小段在干燥箱中80℃烘干后装袋保存。准确称取样品50 g，按表2正交试验设计进行样品液的制备，捣碎后放入烧杯中20℃浸泡，之后将样品烧杯放于电炉上煮沸，并用玻璃棒不停搅拌，浸煮后的样品用单相感应电动机进行抽提，反复抽提3次，收集浸提液，浸提液60℃真空浓缩，在4000 r/min的离心机上离心15 min，然后用蒸馏水定容至50 mL，摇匀，即为待测样品液。

1.2.6 样品中XOs含量的测定 采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS 法）（宁正祥，1998），取待测样品液1 mL、蒸馏水1 mL、3，5-二硝基水杨酸试剂1.5 mL加入25 mL刻度试管中，其余操作均与制作标准曲线相同，在波长540 nm处测定吸光度值。做3个平行试验，取平均值。依据标准回归方程，计算样品中XOs的含量。

1.3 数据统计分析 对所有测定值的差异显著性进行方差分析（AOV），当差异显著时，用多重比较方法来确定各组间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 直观分析 称取9份50 g第三次出菇期平菇菌质干燥样品，进行9种不同试验处理。由表3可知，按照极差R值的大小，影响提取效果的因素的主次顺序为：A＞D＞B＞C （即颗粒细度＞处理液的pH值＞浸泡时间＞浸煮时间），各因素水平的优劣顺序为：A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1、D1＞D3＞D2。

表3 正交试验设计与试验结果

2.2 方差分析 由表4可见，颗粒细度（A）、pH值（D）对XOs提取效果的影响差异极显著（P＜0.01）；浸泡时间（B）对XOs提取效果的影响差异显著（P ＜ 0.05）；而浸煮时间（C）对 XOs提取效果的影响差异不显著（P＞0.05）。由上述试验结果可知，第三次出菇期平菇菌质中XOs的最佳提取工艺确定为A3B3C3D1，即平菇菌质12000 r/min捣碎，浸泡48 h，浸煮1.5 h，处理液pH值为3.50。

表4 正交试验设计方差分析结果

2.3 各生长时期平菇菌质中XOs含量的检测 根据正交试验所确定的最佳提取工艺处理各生长时期菌质样品，再利用DNS法结合标准回归方程即可得到各时期样品中XOs的含量，试验结果见图1。

图1 各生长时期平菇菌质中XOs含量

由图1可知，在平菇的整个生长过程中，XOs含量基本呈先上升后下降的趋势，在第一次出菇期达到高峰。

3 讨论与结论

随着平菇的规模化生产和栽培技术的普及，平菇菌质已成为数量十分可观的一种重要饲料资源，经过平菇菌丝体的生物固氮和酶解作用等一系列生物转化过程，平菇菌质中粗蛋白质和粗脂肪的含量有所提高，而其中的纤维素、半纤维素和木质素等均被不同程度地降解，其营养价值得到显著改善（张纯等，2012）。制备XOs的主要原料就是木聚糖类半纤维素，目前XOs的生产多数是使用化学方法处理木聚糖后，再进行XOs的酶法水解，此法对工业规模和成本有较高要求，而且会产生大量废水。因此，XOs产品主要应用于人类食品添加剂，由于成本较高，在饲料行业的应用受到限制（徐光胜和丁小玲，2013；谢全喜等，2012）。本试验利用稻草为培养基栽培平菇菌种，通过菌丝体在生长繁殖过程中产生的木聚糖酶降解木聚糖类半纤维素，从而生成XOs。然后通过生理生化方法处理各生长时期菌质样品，从中提取XOs。结果表明：12000 r/min捣碎，用pH=3.50的酸性液浸泡48 h，再浸煮1.5 h是从平菇菌质中提取XOs的最佳处理组合，其中菌质的颗粒细度及处理液的pH值对提取XOs的影响最大。

平菇真菌自担孢子萌发后，至少要经过三个阶段才能完成其整个生活史：即菌丝生长阶段、子实体分化和子实体发育阶段（凌丽绢，1995）。本试验发现XOs的含量在第一次出菇期达到最高。其原因可能是平菇真菌在生长过程中，所需的碳素营养是通过菌丝体分泌的各种胞内酶或胞外酶（如纤维素酶、木聚糖酶等）将稻草基质中的纤维素、半纤维素等大分子物质逐步降解成可溶性小分子而提供的，菌丝体内贮藏的碳源越来越多，为子实体的形成提供基础，其中纤维素的吸收利用优于半纤维素，故XOs的峰值出现在第一次出菇期，但随着出菇次数的增加，菌丝不断生长，基质中的养分消耗增多，XOs的含量也逐渐降低，具体机制仍有待于进一步研究。

综上所述，平菇菌质中含有一定量具有众多优良生理活性的低聚木糖，增加了菌质的附加值，经适当加工处理，即可制成一种新型、高效、安全的功能性饲料或饲料添加剂，降低了低聚木糖产品的应用成本。进一步开发和合理利用平菇菌质，有利于食用菌生产和畜牧业的相互促进和共同发展。

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