CREMτ在睾丸扭转复位后生精功能损伤中的作用

汪清 吴诗潇 韦思明⋆ 潘杭丽

CREMτ在睾丸扭转复位后生精功能损伤中的作用

汪清 吴诗潇 韦思明⋆ 潘杭丽

目的 环磷酸腺苷反应元件调控因子τ（CREMτ）是精子发生必不可少的转录因子。本研究探讨CREMτ在睾丸扭转复位后生精功能损伤中的作用。 方法 20只成年雄性SD大鼠随机分为两组，每组10只。对照组大鼠左侧睾丸假手术。扭转复位组大鼠左侧睾丸扭转，1h后复位。复位后3个月，行睾丸切除术，分析睾丸CREMτ表达和生精功能。 结果 单侧睾丸扭转复位引起同侧睾丸CREMτ表达显著降低，同侧睾丸的生精功能也严重损伤。 结论 睾丸扭转复位后生精功能损伤可能归因于CREMτ表达降低。

睾丸扭转 环磷酸腺苷反应元件调控因子τ 生精功能

睾丸扭转又称精索扭转，在25岁以下男性的发病率为1/4000，并非少见［1］。复位是目前治疗睾丸扭转的主要方法。睾丸复位后虽然存活，但随后出现睾丸萎缩，生精功能损伤。睾丸扭转复位后的损伤机制仍然不明。环磷酸腺苷反应元件调控因子τ（CREMτ）是一个转录因子，在男性生殖细胞中的表达是其他组织的100倍，其调控着生精细胞特异基因的表达，促进精子发生的完成［2］。本研究探讨CREMτ在睾丸扭转复位后生精功能损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠（250～300g）由上海实验动物中心提供。逆转录-聚合酶链反应试剂盒购自Invitrogen公司。CREMτ与β-肌动蛋白的上、下游引物由上海生工生物工程公司合成。CREMτ抗体系Santa Cruz公司产品。β-肌动蛋白抗体来源于Sigma公司。

1.2 制作大鼠睾丸扭转复位模型 20只成年雄性SD大鼠被随机分为两组，每组10只。将氯胺酮（50 mg/ kg）注入大鼠腹腔内麻醉，所有手术在无菌条件下实行。对照组：通过左侧髂腹股沟切口取出左侧睾丸。用11/0丝线穿过睾丸白膜，放睾丸入阴囊，关闭切口。扭转复位组：通过同样的切口暴露左侧睾丸。将睾丸逆时针旋转720°，在睾丸白膜与阴囊之间用11/0丝线缝合固定，保持睾丸扭转状态。1h后，拆除丝线，将睾丸反向旋转到正常位置。睾丸恢复血供，仍然存活，放睾丸入阴囊内，关闭切口。复位后3个月，大鼠行双侧睾丸切除术，分析CREMτ表达和睾丸生精功能。

1.3 评估睾丸生精功能 睾丸切下后称重，然后制作石蜡切片，苏木素、伊红染色（HE染色）。在显微镜下观察曲细精管，测量曲细精管直径、生精细胞层数，并行Johnsen评分。

1.4 检测CREMτ mRNA和蛋白表达水平 用逆转录-聚合酶链反应的方法测定睾丸中CREMτ mRNA表达水平。CREMτ的上游引物是5'CCTCTGATGTGCCTGGTATT3'，下游引物是5'GCTGATTGTGCTGCATACTG3'，扩增长度是262bp。β-肌动蛋白作为内参照，它的上游引物是5'ACTGGCATTGTGATGGACTC3'， 下游引物是5'CAGCACTGTGTTGGCATAGA3'，扩增长度是453bp。用蛋白印迹法检测睾丸中CREMτ蛋白表达水平。CREMτ条带与内参照β-肌动蛋白的条带密度比值代表CREMτ表达水平。

1.5 统计学分析 用GraphPad Prism 4.0软件分析。数据以（x±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 睾丸生精功能 与对照组比较扭转复位组同侧睾丸（扭转复位睾丸）的重量、曲细精管直径、生精细胞层数和Johnsen评分明显降低（P＜0.05）；两组对侧睾丸（即右侧睾丸）的上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、2。

图1 （A）两组大鼠睾丸重量。（B）曲细精管直径。（C）生精细胞层数。（D）Johnsen评分。斜线柱表示同侧睾丸；空白柱表示对侧睾丸。 与对照组比较，＊P＜0.05；与同组对侧睾丸比较，﹟P＜0.05。

图 2 睾丸组织学。（A）对照组双侧睾丸和扭转复位组对侧睾丸均显示正常的曲细精管直径和生精细胞层数。（B）延长的精子细胞（箭头所指处）和成熟的精子（箭所指处）。（C）扭转复位组同侧睾丸显示曲细精管萎缩和生精细胞层数减少。（D）生精细胞仅发育到早期精子细胞阶段，也就是圆形精子细胞阶段（箭所指处），缺乏延长的精子细胞和成熟的精子。所有图片均HE染色，图A和C放大100倍，图B和D放大400倍。

2.2 睾丸CREMτ表达水平 扭转复位组同侧睾丸的CREMτ mRNA和蛋白表达水平与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两组对侧睾丸的CREMτ表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、4。

图 3 对照组和扭转两组 （A）大鼠睾丸的CREMτ mRNA。（B）CREMτ蛋白表达水平。斜线柱表示同侧睾丸；空白柱表示对侧睾丸。 与对照组比较，＊P＜0.05； 与同组对侧睾丸比较，﹟P＜0.05。

图 4 两组睾丸CREMτ表达分析。（A）用逆转录-聚合酶链反应的方法分析CREMτ mRNA表达水平。M表示DNA标记；N表示阴性对照（用去离子水代替cDNA）；1L和1R表示对照组左侧（即同侧）和右侧（即对侧）睾丸；2L和2R表示扭转复位组同侧和对侧睾丸。β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照。（B）蛋白印迹法分析CREMτ蛋白表达水平。与对照组比较，扭转复位组同侧睾丸的CREMτ mRNA和蛋白表达水平显著降低。两组对侧睾丸之间比较无明显差异。

3 讨论

睾丸扭转是泌尿外科急症，目前治疗睾丸扭转的主要方法是复位。如果睾丸扭转后6h未治疗，梗死将发生。睾丸扭转患者即使在＜6h接受了复位手术，同侧睾丸也会发生萎缩，生精功能障碍。本文动物实验中，大鼠仅1h的睾丸扭转，复位后虽然存活，但复位后3个月睾丸生精功能严重损伤。睾丸损伤的分子机制仍然不明。

CREMτ mRNA编码CREMτ蛋白。CREMτ蛋白作为转录激活因子，激活生精细胞特异基因的转录［2］。因此，CREMτ是控制生精细胞分化的总开关。用同源重组技术使大鼠CREMτ基因突变，于是睾丸中CREMτ表达缺乏，导致大鼠睾丸重量减轻20%～25%，曲细精管直径缩小20%～30%，精子发生阻断在早期精子细胞阶段，即圆形精子细胞阶段，缺乏延长的精子细胞和成熟的精子［2］。由此可见，CREMτ表达对精子发生必不可少。本资料中单侧睾丸扭转复位引起同侧睾丸精子发生严重损伤，表现为睾丸重量减轻，曲细精管直径缩小，生精细胞层数减少，Johnsen评分降低。在受损伤的睾丸，生精细胞仅发育到圆形精子细胞阶段，缺乏延长的精子细胞和成熟的精子。此外，受损伤睾丸的CREMτ表达水平也显著降低。因为睾丸中CREMτ表达对精子发生必不可少，所以单侧睾丸扭转复位后同侧睾丸生精功能损伤可能归因于CREMτ表达降低。

单侧睾丸扭转复位是否会影响对侧睾丸生精功能，目前仍有争议。一些研究表明［3］，单侧睾丸扭转复位通过自身免疫、交感神经反射等机制引起对侧睾丸损伤。而其他研究者认为［4］，单侧睾丸扭转复位未影响对侧睾丸生精功能。本资料中，虽然单侧睾丸扭转复位导致同侧睾丸CREMτ表达水平和生精功能显著降低，但对侧睾丸无任何改变。因此，单侧睾丸扭转复位未导致对侧睾丸损伤。

总之，单侧睾丸扭转复位后，即使同侧睾丸仍然存活，但它的精子发生严重障碍。睾丸CREMτ表达降低可能是引起生精功能损伤的原因。睾丸扭转引起精索内血管受压阻塞，导致睾丸缺血；复位使睾丸恢复血液供应。因此，睾丸扭转复位后的损伤是一个缺血再灌注损伤。睾丸缺血再灌注后活性氧大量产生。活性氧能调控许多基因的表达［5］。单侧睾丸扭转复位后，同侧睾丸CREMτ表达降低是否由活性氧引起，目前仍然不明，需要进一步研究来阐明。

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3 Minutoli L, Antonuccio P, Squadrito F, et al. Effects of polydeoxyribonucleotide on the histological damage and the altered spermatogenesis induced by testicular ischaemia and reperfusion in rats. Int J Androl,2012,35(2):133～144.

4 Çayan S,Saylam B,Tiftik N,et al. Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor,Y-27632,on oxidative stress,spermatogenesis,and apoptosis. Urology,2014,83(3):675. e13～18.

5 Kaminskyy VO,Zhivotovsky B. Free radicals in cross talk between autophagy and apoptosis. Antioxid Redox Signal,2014,21(1):86～102.

Objective The cAMP-responsive element modulator-τ（CREMτ）is an essential transcription factor for spermatogenesis. This study investigated role of CREMτ in spermatogenic injury after testicular torsion-detorsion. Methods Twenty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups，each containing 10 rats. Ten rats in control group underwent a sham operation of left testes. Ten rats in torsiondetorsion group received 1 hour of left testicular torsion. All rats underwent orchiectomy at 3 months after repair of torsion for analysis of testicular CREMτ expression and spermatogenesis. Results Unilateral testicular torsion-detorsion caused significant reduction in CREMτ expression in ipsilateral testes. The spermatogenesis in ipsilateral testes was also seriously injured. Conclusion Impairment of spermatogenesis after testicular torsiondetorsion may be due to reduction in CREMτ expression.

Testicular torsion cAMP-responsive element modulator-τ（CREMτ） Spermatogenesis

浙江医学高等专科学校博士科研启动基金资助项目（2008B05）

310053 浙江医学高等专科学校

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