分子诊断技术在卵巢癌个体化诊治中应用的现状与进展△

韩瑛 李淑敏

北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院妇瘤科，北京 100021

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中的发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌列居第三位，但其死亡率却位居第一位。主要原因是卵巢癌很难被早期发现，75%的患者就诊时已属晚期，经肿瘤细胞减灭术及术后化疗初治后的多数患者的病情获得临床完全缓解，但其中仍有50%以上的患者于治疗后疾病复发，终因肿瘤耐药而发生疾病进展甚至死亡。目前为止，在全球范围内卵巢癌的治疗仍缺少标准二线化疗方案。虽有多种药物可被用于治疗复发性卵巢癌，但有效率多低于30%，尤其对复发耐药和难治性卵巢癌的疗效更低，同时对患者在有限生存期内的生活质量造成负面影响。近年来，随着肿瘤患者的个体化治疗与疗效和预后的关系受到临床医生的普遍关注和重视，卵巢癌的个体化治疗也日益成为妇科恶性肿瘤的研究热点，晚期、复发性卵巢癌尤其适宜个体化治疗，而实现个体化治疗的前提条件是特异性的分子诊断技术的应用。目前，分子诊断技术已被广泛应用于恶性肿瘤的早期诊断、分子分型、生物学行为、预后的预测、药物筛选和疗效监测等各个方面，但其在卵巢癌个体化诊治方面的研究还处于起步阶段，仍需予以积极的探索和研究。

1 个体化治疗的概念及意义

个体化治疗是以每位患者的信息为基础来制定治疗方案，通常根据基因的组成或表达变化的差异来评估患者的治疗效果或毒副作用等，对每位患者进行最适宜的药物治疗[1]。其主要意义在于综合患者的个体情况选择合适的治疗方案，旨在提高治疗的针对性，保护患者免于依经验和（或）指南用药无效所致的再次选择有效药物时造成的治疗时间延迟，同时减少或避免化疗药物对机体造成的不良反应，并减轻患者的精神心理负担和经济负担，最大程度地延长患者的生存期。近年来，针对肿瘤患者的个体化治疗研究已成为肿瘤学家们关注的热点，而完善的分子诊断技术则是实现患者个体化治疗的基础和前提。

2 分子诊断技术的定义和分类

分子诊断技术是直接以疾病相关的基因及其产物为检测对象，从分子水平上探讨疾病发生和发展的机制，提供肿瘤患者体内遗传物质的结构、表达水平、相关表观遗传学信息，及参与抗肿瘤药物代谢相关基因的结构及表达状态等参数的技术，从而为疾病的预防与诊断、疗效评估、预后判断等提供关键的信息和决策依据。20世纪70年代，Kan等[2]首次应用DNA分子杂交技术成功诊断了镰状细胞贫血症，这标志着临床检验开始进入分子诊断时代。20世纪80年代中期，随着PCR方法的建立，分子诊断技术的应用范围被不断扩大，尤其在遗传性和肿瘤性疾病的诊断方面获得了广泛应用[3-6]。随着基因检测技术及基因分析工具的飞速发展，分子诊断技术也不断被革新。目前，较为成熟的分子检测技术包括基因芯片、荧光原位杂交、RNA印迹、蛋白芯片、蛋白印迹及流式细胞技术等[7]。开展个体化治疗，探寻高敏感度和特异度的分子标志物尤为重要，当今采用分子诊断技术进行基础和临床研究的标志物主要包括：①DNA水平的标志：基因突变、单核苷酸多态性、染色体异常、DNA拷贝数目的改变、异常甲基化；②RNA水平的标志物：转录因子和micro-RNA的表达水平等；③蛋白质水平的标志或标志物：生长因子、细胞表面受体、蛋白质的磷酸化状态以及肿瘤细胞释放到血清中的多肽物等[7]。检测肿瘤组织中的基因突变、mRNA表达水平和基因分型等参数，为临床个体化治疗提供了科学依据，提高了药物治疗的有效率，也降低了药物的毒副作用。目前，已有多种分子水平的检测方案被纳入肿瘤个体化治疗的临床诊疗指南。

3 分子诊断技术在恶性肿瘤诊治中的应用

分子诊断技术已被用于乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的诊断及治疗中，主要在肿瘤的早期诊断、分子分型、预测生物学行为和预后、药物筛选和疗效监测等方面发挥作用。

3.1 用于预测发生恶性肿瘤的高危患者或早期诊断

分子诊断技术通过检测某些基因的改变可预测发生相关肿瘤的高危人群，尤其是有肿瘤家族史者；或及早发现隐匿性的早期肿瘤患者，及时采取有效干预措施，可大大提高治愈率，降低死亡率。早期研究证实BRCA1/2基因突变会增加卵巢癌与乳腺癌的发病风险。关于预防性卵巢切除与原发性卵巢、输卵管或腹膜癌发生和死亡风险关系的前瞻性研究的结果显示，预防性卵巢切除能使原发性卵巢、输卵管和腹膜癌发生的风险降低80%，相关的死亡风险降低77%。该研究从一项国际权威检测机构中选出5738例已证实携带BRCA1/2基因突变的女性，研究对象入组时需填写一份包含其基本信息、生育史、手术史（包括预防性卵巢切除手术史）及激素使用情况等项目的基础调查问卷，并通过后续的调查问卷及电话的形式进行随访，直至其被诊断出患有卵巢癌、输卵管癌及腹膜癌中的任何一种疾病或死亡为止，并用时间依赖性生存分析法评估双侧卵巢切除术后肿瘤的发生率及总死亡率的危险比[8-9]。2008年，有研究通过检测微卫星的不稳定性和MLH1、PMS2、MSH2及MSII6四个错配修复蛋白的表达，对500例结肠癌患者进行Iynch综合征（遗传性部位特异性结直肠癌）的筛查结果表明，这两种方法筛查lynch综合征的有效率分别为100%和94%[10-11]。2014年美国国家癌症综合网络（NCCN）肿瘤学临床实践指南推荐用该诊断技术筛查新诊断结直肠癌患者中的Lynch综合征，据统计每35例新诊断结直肠癌患者中可检出1例Iynch综合征。因此，应用特异性的分子诊断技术可及早发现相应肿瘤的高危人群或第二原发癌并及时给予有效的干预措施，这样可大大降低癌症的发生率和死亡率。

3.2 用于恶性肿瘤的分子分型

与传统依赖显微镜下肿瘤细胞形态特征进行的肿瘤分型相比，分子诊断技术肿瘤分型的主要区别在于可从分子水平对肿瘤进行更细微、更准确的分析，进而更精准地评估肿瘤的生物学行为和患者的预后，最终指导临床个体化治疗。根据基因微阵列技术检测的乳腺癌组织中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）的表达状态，将乳腺癌患者分成五种亚型，具体为：①Luminal A型：ER（+）和（或）PR（+）、HER-2（-），此型乳腺癌患者经内分泌治疗的效果佳，且预后较好；②Luminal B型：ER（+）和（或）PR（+）、HER2（+），此型乳腺癌患者的预后差，且该分型尚未被认可；③HER-2过表达型：ER（-）和（或）PR（-）、HER-2（+），该型占 18%～20%，且曲妥珠单抗为此型患者的有效靶向治疗药；④基底样亚型：ER（-）和（或）PR（-）和 HER-2（-），此型乳腺癌的侵袭性强，患者预后最差，3年生存率仅为66.9%，曲妥珠单抗和内分泌治疗均无明显疗效，而抗HER-l的单克隆抗体、新型紫杉醇ABI-007和达沙替尼治疗均有效；⑤类似正常组织（normallike）的乳腺癌：此型患者的基因表达谱类似于正常的乳腺组织腺上皮细胞[12]。据此分型不但可以判断乳腺癌的生物学行为，还具有指导患者术后个体化治疗等优点。

3.3 用于指导恶性肿瘤的治疗

近年，分子诊断技术用于指导恶性肿瘤的治疗主要体现在分子靶向药物的选择方面。分子靶向治疗药物具有特异性较高和不良反应较小的优点，但费用昂贵，且研究发现分子靶向药物并不是对所有的肿瘤患者都有效[11，13]。Postiglione 等[15]研究发现，吉非替尼仅对伴有EGFR突变的非小细胞肺癌患者有效，可以显著提高EGFR突变阳性患者的无进展生存期和客观缓解率。目前已证实，EGFR突变是预测吉非替尼治疗非小细胞肺癌患者临床获益的最佳指标[14]。西妥昔单抗也是一种表皮生长因子受体抑制剂，主要用于转移性结直肠癌患者的治疗，但很多研究均显示西妥昔单抗仅对KRAS基因野生型的结直肠癌患者有效，而对携带KRAS基因突变型的患者无效[17]。2009年NCCN和美国临床肿瘤协会已推荐：所有的晚期转移性结直肠癌患者治疗前均应检测KRAS基因状态，将野生型KRAS基因作为选择抗EGFR靶向药物治疗的分子标志物[15]。所以，有效分子靶标的检测是实现肿瘤患者个体化治疗的必要条件，这样既提高了疗效，又减少了盲目用药给对某些药物无效的患者带来的不良反应和经济负担。

3.4 用于预测恶性肿瘤患者的预后

分子诊断技术检测与肿瘤预后相关的标志物可预测肿瘤患者的预后。Siemens等[16]在一项病例-对照研究中将94例原发性直肠癌患者分成试验组（n=47；发生肝转移者，M1）和对照组（n=47；无远处转移者，M0），并检测入组患者肿瘤组织中miR-34a和miR-34b/c启动子CpG岛的甲基化水平、miR-34a和miR-34a作用靶标（c-MET、Snail和β-catenin）的表达水平。结果显示，miR-34a甲基化（P=0.014）、c-MET（P=0.031）和β-catenin的高表达（P=0.058）均与结肠癌发生远处转移呈正相关，且在远处转移的肿瘤组织中这3个标志物的出现频率异常高。这提示，同时检测miR-34a甲基化水平、c-MET和β-catenin的表达水平可作为预测结直肠癌患者发生远处转移的指标。

4 分子诊断技术在卵巢癌诊治中的研究进展

目前在卵巢癌诊治中应用最成熟的分子诊断技术是血清CA125的检测。CAl25是卵巢上皮性肿瘤诊治过程中首选的肿瘤标志物，主要应用于卵巢癌的诊断、治疗后的病情监测及预后评估，是目前临床应用最广泛的卵巢癌相关的分子标志物，已成为卵巢癌诊治不可或缺的一部分。但使用单一CAl25检测的结果存在一定的假阴性率和假阳性率，有研究表明CAl25的检测水平还受到患者诸多个体因素的影响，如种族、年龄、子宫切除、吸烟史及肥胖等[17]。另外，截至目前，对建立在分子诊断技术基础上的卵巢癌个体化治疗的相关研究还比较少。因此，进一步探寻并建立完善的分子诊断技术，提高卵巢癌早期诊断的准确率和指导卵巢癌患者的个体治疗是极其必要的。

4.1 预测卵巢癌患者预后及新型治疗靶点

Cheon等[18]选择3个权威的录有卵巢浆液性腺癌临床资料的数据库，通过基因微阵列技术筛出一组出现频率最高并与卵巢癌进展和总生存率低相关的10个基因标签，包括AEBP1、COL11A1、 COL5A1、 COL6A2、 LOX、 POSTN、SNAI2、THBS2、TIMP3和VCAN，随后检测并分析了这10个基因在卵巢癌患者体内的表达状态与总生存率关系的相关信息。结果显示，3个数据库的卵巢癌患者中，基因高表达者的总生存率较差，且风险比 分 别 为 0.64、0.54和 0.624（p＜0.01）。Cheon[20]等经深入研究发现，这组基因均受到TGF-β1的调节，推测TGF-β1可能成为卵巢浆液性腺癌的一个治疗靶点。他们的研究还发现，这10个基因都共同参与了癌细胞胶原蛋白基质的形成过程，而丰富的胶原蛋白基质可以保护癌细胞免于化疗的损伤。由此推测，这10个基因的高表达状态可能与患者对化疗药的抗拒从而导致这部分卵巢癌患者的预后差有关。该发现也为探寻新的治疗靶点奠定了基础，其中COL11A1基因在卵巢癌的发展过程中表达最为丰富，动物实验也已证实阻断其在鼠类癌细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的生长和扩散[18]。

内皮因子CD105是一种膜结合糖蛋白，其本质为血管生成因子。它在卵巢癌、白血病、胃肠道间质肿瘤及黑色素瘤等多种恶性肿瘤的组织中过度表达，且与患者的预后差相关[19-20]。另有研究结果提示，CD105高表达的卵巢上皮性癌与铂类耐药有关[23]。此外，Bock等[20]还发现CD105的抑制剂不但能降低肿瘤细胞的活性，增加肿瘤细胞的凋亡，介导肿瘤细胞双链DNA断裂，还能增加肿瘤细胞对铂类的敏感性（增加2～4倍）。裸鼠体内实验验证了抗内皮因子治疗可以明显减小肿瘤体积（重量减少了35%～41%，p＜0.05）的想法，且研究还发现内皮素抑制剂与铂类联合治疗还可以得到更好的抑瘤效果（重量减少了58%～62%，p＜0.001）[22]。因此，抗内皮素治疗可能成为卵巢上皮性癌治疗的新切入点。

4.2 用于指导卵巢癌的靶向治疗

最近有研究报道[25]多聚二磷酸腺苷核糖多聚酶抑制剂（PARP-inhibitor）奥拉帕尼对携带BRCA¯1/2基因突变的卵巢上皮癌有明显的抗肿瘤作用，且与铂类化疗药物的敏感性相关。BRCA1/2基因突变携带者的肿瘤细胞都存在同源重组DNA修复缺陷，而PARP抑制剂可使不能修复的DNA单链或者双链断裂，最终导致肿瘤细胞死亡。Fong等[23]对奥拉帕尼进行了一项共纳入50例携带BRCA1/2基因突变的复发性卵巢癌患者（铂敏感型13例、铂耐药型24例、难治型13例）的Ⅰ期临床研究。结果显示：20例（40%）达到完全缓解或部分缓解，3例（6.0%）达到疾病稳定并维持超过4个月，客观缓解率为46%。且进一步分层分析发现，奥拉帕尼治疗铂类敏感型复发卵巢癌患者的有效率为69%，高于铂类耐药型（45%）和难治型（23%），这说明分子检测技术有助于指导新的靶向药物的临床应用[23]。

4.3 指导复发性卵巢癌的个体化治疗

Kim等[26]首先收集了4个卵巢上皮癌数据库中录入的783例患者的临床资料，随后结合药物敏感性试验及这些患者初次化疗的临床数据资料，经回顾性分析建立了一个COXEN（co-expression extropolation）分子生物学模型，确立了与紫杉醇、环磷酰胺及拓扑替康敏感性相关的分子标志物（包括：20个与紫杉醇敏感性相关的基因，44个与环磷酰胺敏感性相关的基因，58个与拓扑替康敏感性相关的基因），最后在185例复发性卵巢癌的二线化疗中进行了验证。结果显示，COXEN分子生物学模型能够准确预测这三种化疗药物治疗复发性卵巢癌患者的近期疗效及远期疗效。

另外，Kim的这项前瞻性研究展示了生物标志物在107例复发性上皮性卵巢癌患者复发治疗中（使用三种化疗药物之一）的潜在临床效益，结果表明经预测选的最佳药物化疗的复发性上皮性卵巢癌患者的中位总生存期延长了21个月。对于铂类敏感的患者来说，如果使用经预测选择的最佳药物化疗，其生存期将被延长更久。这项研究表明，基于生物分子标志物选择基础上的个体化治疗可提高上皮性卵巢癌患者的生存率，是分子诊断技术用于卵巢癌治疗的重要证据[24]。

5 小结

综上所述，分子诊断技术在恶性肿瘤的风险评估、早期诊断、分子分型、肿瘤生物学行为预测、预后评估、药物筛选、疗效监测等研究和临床应用方面体现出巨大的优势，但其在指导肿瘤患者的个体化治疗，尤其是晚期/复发性卵巢癌患者的个体化治疗应用方面的研究较少。因此，分子诊断技术还需被进一步研究，以明确其被用于肿瘤个体化治疗的准确性及意义。

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