华法林对心力衰竭模型大鼠心功能及心肌Na+-K+-ATPase亚基表达的影响

罗园珍　李军华　(武汉铁路职业技术学院，湖北　武汉　430205)



华法林对心力衰竭模型大鼠心功能及心肌Na+-K+-ATPase亚基表达的影响

罗园珍李军华(武汉铁路职业技术学院，湖北武汉430205)

〔摘要〕目的探讨华法林对心力衰竭模型大鼠心功能及对心肌Na+-K+-ATPase亚基表达的影响。方法选取Wistar大鼠88只，按随机数字表达法随机分为正常组、模型组、地高辛组(32 μg/kg)、华法林组(0. 25 mg)，每组22只。除了正常对照大鼠外，其他三组大鼠行心力衰竭模型手术，正常组行假手术造模，于造模第3周起予以各组大鼠相应的药物进行灌胃治疗，1次/d，连续灌胃4 w。末次灌胃后采用彩色多普勒超声诊断仪测定各组大鼠的心功能指标左心室射血分数(LVEF)及左心室舒张末内径(LVEDD);采用酶联免疫方法检测各组大鼠动脉血清的脑钠肽(BNP)含量;采用Western印迹和RT-PCR检测各组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2亚基蛋白及mRNA相对表达量。结果①与正常组相比，模型组大鼠LVEF明显降低，而LVEDD、BNP明显升高(P＜0. 01);与模型组相比，地高辛组和华法林组大鼠LVEF明显升高，而LVEDD、BNP明显降低(P＜0. 05);②与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2亚基蛋白及mRNA相对表达量明显降低(P＜0. 01);③与模型组相比，地高辛组和华法林组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2亚基蛋白及mRNA相对表达量明显升高(P＜0. 05)。结论心力衰竭大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase亚基处于低表达水平，华法林能够通过升高Na+-K+-ATPase亚基表达，改善心衰大鼠心功能，降低脑钠肽含量，对临床具有指导意义，值得临床推广。

〔关键词〕华法林;心力衰竭;心功能; Na+-K+-ATPase

心力衰竭是各种心血管疾病的最终结果，表现为呼吸困难和无力而导致体力活动受限和水肿〔1〕。本病多发于中老年人群，并有逐年上升趋势〔2〕。导致本病原因以原发性心肌损害和心脏负荷过重为主。现代医学多采取去除诱因，强心、利尿、扩血管为主要治疗大法。目前临床中采用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)作为治疗心衰的一线用药，但长期使用会造成不同程度的咳嗽、心悸和头晕，降低患者的生活质量。研究发现〔3〕，华法林具有抑制凝血因子的活性，抑制血栓的形成，能够有效清除已形成的血栓，提高心力衰竭患者预后。本文通过观察心衰模型大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末内径(LVEDD)、脑钠肽(BNP)、Na+-K+-ATPase亚基表达水平变化，来探究华法林对心衰的影响及作用机制。

1　资料与方法

1. 1动物6周龄Wistar雄性大鼠88只，平均体重(153± 14)g，大鼠购于中国科学院上海动物中心(合格证号: D20021024)。

1. 2药品、试剂及仪器华法林钠(生产单位:上海信谊药厂有限公司，批准文号:国药准字H31022123，2010-06-09);地高辛(上海信谊药厂有限公司，批准文号:国药准字H31020678，2009-11-24); BNP试剂购于赛驰生物公司; Trizol试剂购于美国GIBCO公司;大鼠ATP α1、α2核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、超纯RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购于美国Promega公司; Philips-IE33彩色多普勒超声诊断仪，购于美国PHILIPS公司，频率为3～8 mHz小儿心脏探头。

1. 3心衰大鼠模型建立将88只Wistar雄性大鼠按随机数字表达法随机分为正常组、模型组、地高辛组(32 μg/kg)、华法林组(0. 25 mg/d)，每组22只。除正常对照组，其他三组大鼠行心力衰竭模型手术，腹腔注入10%水合氯醛麻醉后，备皮消毒，无菌操作下于胸骨左侧切开皮肤，逐层分离肌肉，剪开心包，暴露心脏，于左心耳下缘进针深约1. 5 mm，从右上方肺动脉圆锥方向出针，稳定约1 min后，将结扎线收紧，结扎，逐层缝合，结束造模手术。正常组大鼠行开关手术，腹腔注射麻醉后，备皮，消毒，无菌操作下切开皮肤，逐层分离肌肉，剪开心包，暴露心脏，然后逐层缝合，结束手术。四组大鼠手术后均置于相同环境下饲养2 w，采用Philips-IE33彩色多普勒超声诊断仪检测心动图，若射血分数＜50%，说明心衰造模成功。造模成功后，正常组和模型组予以10 mg/kg生理盐水灌胃;地高辛组予以32 μg/kg地高辛灌胃;华法林组给予0. 25 mg华法林钠灌胃;各组大鼠灌药治疗4 w，每天灌药1次。

1. 4观察指标及检测方法

1. 4. 1各组大鼠心功能测定四组大鼠予以相应药物灌胃治疗4 w后，用10%的水合氯醛将大鼠进行麻醉，胸口备皮，采用Philips-IE33彩色多普勒超声诊断仪测量计算LVEF及LVEDD，取2个心动周期，算其平均值。

1. 4. 2各组大鼠血液中BNP水平测定麻醉理想后，消毒，无菌操作下打开胸腔，剪开心包，暴露心脏及主动脉，抽取主动脉血5 ml，加入含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝剂的真空管中混匀，采血后，游离心脏，取出心脏浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定24 h。动脉血3 000 r/min离心10 min，抽取血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清中BNP含量。

1. 4. 3 Western印迹法检测四组大鼠Na+-K+-ATPase亚基表达

无菌操作下，分别取四组大鼠心脏组织50 mg，将选取好的组织经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，将洗涤后的组织研磨、离心收集，用冰冷PBS洗涤细胞3次后，加入裂解缓冲液，摇匀，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min离心10 min，吸取上清液，即胞质蛋白。采用二奎啉甲酸(BCA)法对样品蛋白质进行蛋白定量。调整样品蛋白量为30～40 μg后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，并将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PBS洗膜5 min后，PBS溶解封闭PVDF膜2 h。继而加入兔抗人ATP α1抗体、兔抗人ATP α2抗体(按1∶1 000稀释)或抗β-actin(1∶2 000稀释)，置于4℃环境中过夜。PBS洗涤3次，10 min/次，加入二抗，温室孵育2 h。再次用PBS洗涤3次，10 min/次。将PVDF膜增强化学发光法(ECL)显色，在暗室中将PBVF曝光于X光片中，用凝胶成像系统扫描分析结果。

1. 4. 4 RT-PCR法检测四组大鼠心脏组织中Na+-K+-ATPase亚基基因表达水平总RNA的提取:把取出的心脏组织剪碎、研磨，置于0. 2%胶原酶中消化，采用D-Hank液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min离心8 min，制备成单细胞沉淀，向单细胞沉淀中加入1 ml Trizol试剂，采用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。实验操作按产品说明书进行，用紫外分光光度法测定RNA的A260/A280确定总RNA纯度。反转录聚合酶链反应:根据逆转录试剂盒要求进行反转录反应操作，按照相关文献资料设计聚合酶链反应(PCR)中内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、ATP α1和ATP α2引物，将RNA模板、引物、5xRT Buffer和RNase-free水溶解并置于冰上备用，将2 μl Primer mix试剂和10 μl消化后RNA分别加入20 μl反应体系的第一部分，混匀。PCR反应体系为: SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，PCR正义引物(10 μmol/L)0. 4 μl，PCR反义引物(10 μmol/L)0. 4 μl，ROX Reference DyeⅡ0. 4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6. 8 μl，总反应体系为20 μl。经过PCR反应条件的优化，PCR循环条件为94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35个循环，最后72℃再延伸5 min。引物序列见表1。

表1　目的基因的实时定量RT-PCR引物序列

结果分析: PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，溴乙啶染色，通过成像分析scion软件计算和比较ATPα1和ATPα2产物条带的吸光度值，并与GAPDH条带光密度值比较，计算出ATPα1和ATPα2在大鼠心肌组织中mRNA表达含量相对值。1. 5统计学方法应用SPSS17. 0软件进行t检验。

2　结果

2. 1四组大鼠心功能指标比较与正常组比较，模型组大鼠LVEF明显降低(P＜0. 01)，LVEDD及BNP水平明显升高(P＜0. 01);与模型组比较，地高辛组和华法林组大鼠LVEF明显升高(P＜0. 05)，LVEDD及BNP水平明显降低(P＜0. 05)。正常组、地高辛组和华法林组三组大鼠心功能指标相比无明显差异(P＞0. 05)。见表2。

表2　四组大鼠心功能指标比较(x±s，n=22)

2. 2四组大鼠Na+-K+-ATPase蛋白表达的比较与正常组(0. 76±0. 18，0. 64±0. 04)相比，模型组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2蛋白表达水平(0. 19±0. 04，0. 04±0. 02)明显降低(P＜0. 01);与模型组相比，地高辛组(0. 54±0. 13，0. 37± 0. 06)和华法林组(0. 56±0. 12; 0. 35±0. 07)明显升高(P＜0. 05)。正常组、地高辛组和华法林组三组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2蛋白表达水平相比无明显差异(P＞0. 05)。见图1。

2. 3四组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase亚基mRNA表达的比较如图2所示，与正常组(0. 67±0. 09，0. 54±0. 05)相比，模型组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2亚基mRNA表达水平(0. 13±0. 07，0. 11±0. 04)明显降低(P＜0. 01);与模型组相比，地高辛组(0. 44±0. 11，0. 41±0. 07)和华法林组(0. 46± 0. 10，0. 38±0. 05)明显升高(P＜0. 05)。正常组、地高辛组和华法林组三组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1和α2亚基mRNA表达水平相比无明显差异(P＞0. 05)。

图1　四组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1、α2亚基蛋白表达结果

图2　四组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase α1、α2亚基mRNA表达结果

3　讨论

慢性心力衰竭预后差，死亡率高，是严重威胁人类生命健康的主要心血管疾病之一〔4〕。本病以原发性心肌损害及心脏负荷过重为基本病因，以呼吸道感染、心律失常为主要诱因〔5〕。随着人民生活水平的提高，高脂、高糖及不规律饮食是慢性心力衰竭患者处于逐年增长的状态。现代医学中，采用强心、利尿、扩血管为主要治疗原则，ACEI和ARB为目前临床中一线抗心衰治疗药物，虽能起到良好的临床疗效，但是长期服用会导致较严重的副作用，严重影响患者生活质量〔6〕。研究表明〔7〕，Na+-K+-ATP酶在维护心功能中起着重要的作用，当心功能不全时，Na+-K+-ATP酶含量也随之改变。

本研究结果说明Na+-K+-ATPase α1和α2亚基表达与心功能水平呈正相关，心功能越好，Na+-K+-ATPase α1和α2亚基表达越高;华法林和地高辛能够明显提高Na+-K+-ATPase α1和α2亚基表达，从而改善心衰大鼠的心功能。Na+-K+-ATP酶又称钠泵，是一种既具有离子转运、强心甙类配体结合的作用，又有转运酶至血管壁的重要结构蛋白，钠泵能够维持细胞膜内外Na+、K+浓度差，维持正常的细胞兴奋，同时还可以阻止大量的Na+进入细胞膜内，破坏正常的细胞结构和功能，其活动所产生的能量能够为其他生理活动所利用，因此钠泵不仅仅参与心衰的产生，还决定心衰的预后和转归〔8〕。钠泵受损时，使细胞膜内外Na+、K+平衡遭到破坏，使大量Na+进入细胞内，大量K+流出细胞外，而细胞内大量的Na+与Ca2+交换，使细胞内Ca2+的聚集，从而损伤心肌细胞，若血栓堵塞冠状动脉，造成心肌缺血缺氧，从而产生心力衰竭〔9〕。本实验为上述论断提供了证据。华法林为维生素K拮抗剂，具有抑制抗凝蛋白C和S的羟基化，抑制维生素K依赖凝血因子的合成，有效降低了血液凝固〔10〕。研究表明〔11〕，华法林没有溶栓作用，能够通过抑制血栓的形成，清除已形成的血栓，恢复冠状动脉的正常血流量，改善心肌的缺血缺氧状态，恢复正常的心室排出量和心脏功能。华法林对心衰具有治疗作用，能够改善泵血功能，心肌收缩能力，同时升高心力衰竭大鼠Na+-K+-ATPase α1和α2亚基的表达水平。因此推测，华法林可能是通过调节Na+-K+-ATPase α1和α2亚基的表达来实现心衰大鼠心肌功能的改善〔12〕。

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〔2015-01-22修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5747-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 028

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R541

第一作者:罗园珍(1963-)，女，副教授，副主任医师，主要从事内科临床研究。