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菟丝子总黄酮对血管平滑肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响

2015-12-15王晓敏席晓甜刘海云江西中医药大学基础医学院江西南昌330004

中国老年学杂志 2015年20期
关键词:菟丝子平滑肌黄酮

王晓敏 席晓甜 刘海云 谢 斌 (江西中医药大学基础医学院,江西 南昌 330004)



菟丝子总黄酮对血管平滑肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响

王晓敏席晓甜刘海云谢斌(江西中医药大学基础医学院,江西南昌330004)

〔摘要〕目的观察菟丝子总黄酮对血管平滑肌细胞凋亡的影响,并探讨其保护作用机制。方法菟丝子经溶剂提取,聚酰胺柱分离得黄酮提取物;大鼠胸主动脉平滑肌细胞传代培养,实验分四组,采用流式细胞仪检测细胞凋亡、Westen印迹法测定细胞Bcl-2和Bax蛋白表达及RT-PCR测定C-myc基因表达情况。结果菟丝子总黄酮高剂量组能够增加活细胞数量,降低死亡细胞数,特别是降低早期凋亡细胞数,与模型组比较有显著差异(P<0. 05);菟丝子总黄酮高剂量组能够下降Bax蛋白表达量,与模型组比较有显著差异(P<0. 05),而菟丝子总黄酮低剂量组升高Bcl-2蛋白表达量,与模型组比较有显著差异(P<0. 05);菟丝子总黄酮高剂量和低剂量组C-myc mRNA表达量显著升高,与模型组比较有显著性差异(P<0. 05),无剂量依从效应。结论菟丝子总黄酮能抑制平滑肌细胞凋亡,其可能是通过能够下降Bax蛋白和升高Bcl-2蛋白表达,改善抗凋亡和促凋亡的蛋白失衡,增加细胞周期C-myc的基因的表达来发挥对心血管起保护作用。

〔关键词〕菟丝子总黄酮;凋亡; Bcl-2/Bax; C-myc;血管平滑肌细胞

血管平滑肌增殖是引起高血压、动脉粥样硬化和血管成型术再狭窄等心血管疾病的主要发病机制。平滑肌细胞的增殖与凋亡失调,造成了平滑肌细胞数量的过度增加,内膜增厚、管腔变窄由此引起血管形态结构和功能改变,促发心血管疾病〔1〕。抑制血管平滑肌细胞异常增殖已成为当今治疗血管增殖性疾病的主要途径,也成为近几年的研究热点〔2〕。本研究观察温补肾阳的要药有效部位——菟丝子总黄酮血管平滑肌细胞的保护作用,探讨其对血管的保护作用机制。

1 材料和方法

1. 1药物与仪器菟丝子经本院中药鉴定教研室鉴定为Cuscuta Chinensis Lam的成熟种子,经溶剂提取,聚酰胺柱分离得总黄酮提取物,含量为85%〔3〕。DMEM培养基(美国Gibco),新生小牛血清(杭州四季青生物公司); Trizol试剂、AMV试剂(大连宝生生物工程有限公司); Bcl-2、Bax一抗(Santa Cruz公司); Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术公司)。高速冷冻离心机(美国Sigma),核酸蛋白分析仪(日本岛津公司),垂直电泳仪、转移槽、梯度PCR仪(Bio-Red PTC 200),凝胶成像系统(美国Sigma),流式细胞仪(美国Becton Dinson公司FACScan)。Imago-pro plus 6. 0图像分析软件(美国冷泉仪器公司)。

1. 2主要方法和步骤

1. 2. 1血管平滑肌细胞的培养将SD大鼠胸主动脉用Hanks液冲洗去除残余血液,剥去外膜,弯头镊子轻刮去内膜后剪成1 mm×1 mm的小块,均匀涂布瓶壁,加入20%FCS的DMEM的培养基后,放置37℃、5%CO2将培养孵箱中培养1~2 h,将瓶缓慢翻转平放,静置培养。待2 w后,80%组织块爬出的细胞融合。在倒置显微镜下,呈现平滑肌细胞典型的“峰”、“谷”样生长和α-actin免疫组化法染色鉴定为血管平滑肌细胞〔4〕。

1. 2. 2实验分组取P4~P6代细胞分为正常组(正常血管平滑肌细胞培养基);模型组(ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基,过氧化氢终浓度200 mmol/L);菟丝子总黄酮高剂量组(10 mmol/L+过氧化氢终浓度200 mmol/L);菟丝子总黄酮低剂量组(5 mmol/L+过氧化氢终浓度200 mmol/L)。取对数生长的第4代血管平滑肌细胞,以1×103个/孔细胞浓度接种于96孔培养板中,补液至100 μl,待细胞生长融合达50%时,换以含2% FBS DMEM培养液,37℃、5% CO2培养箱中培养24 h,按实验分组换液,每组设置5个复孔,置37℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h,换以含1 g/L MDMEM培养液,37℃孵育4 h,提取总RNA和蛋白。

1. 2. 3 RT-PCR测定C-myc mRNA表达Trizol一步法提总RNA,以蛋白核酸分析仪测定RNA浓度; M-MuLV逆转录酶催化合成cDNA;用Primer5软件设计引物(正义链: CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG,反义链: AATTGTGCTGGTGCGTGGAC;β-actin:正义链: CCCATCTATGAGGGTTACGC,反义链: TTTAATGTCACGCACGATTTC); PCR扩增目的基因,反应条件: 94℃预变性5 min; 94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min(35个循环); 72℃延伸10 min。取5 μl PCR扩增产物于1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳,应用凝胶成像系统灰度扫描。胶片进行灰度扫描,以目的条带的灰度值与β-actin条带的灰度值的比值进行分析。

1. 2. 4 Westen印迹法测定血管平滑肌细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达根据蛋白提取液试剂盒说明书,提取细胞总蛋白,取少量用BCA法测定蛋白浓度,加入5×SDS凝胶上样缓冲液,沸水浴5 min,取等量蛋白,10%SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2 h,经TBST充分漂洗(10 min×3),加兔抗人多克隆抗体(稀释度: Bcl-2蛋白1∶500; Bax蛋白1∶300;β-actin 1∶1 000)4℃孵育过夜,充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀释度为1∶1 000)室温孵育2 h,洗涤后ECL增强化学发光显色,β-actin作为内参照,凝胶图像分析仪分析结果。

1. 2. 5 Annexin V-FITC法检测凋亡平滑肌细胞用磷酸缓冲液(PBS)液离心洗涤2次,将离心沉淀的细胞加入冰70%乙醇固定,保存4℃冰箱24 h,将固定的单细胞悬液调至为1×106/ml的浓度。取1 ml细胞,1 000 r/min,4℃离心10 min,弃上清。重复3次。将细胞重悬于200 μl上样缓冲液。加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,轻轻混匀,4℃反应30 min。加入300 μl上样缓冲液,在1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1. 3统计分析采用SPSS16. 0软件,进行单因素方差分析,两两比较方差齐时LSD检验,方差不齐时用Dunnett T3检验。

2 结果

2. 1菟丝子总黄酮对动脉平滑肌细胞的凋亡影响菟丝子总黄酮高剂量组和低剂量组的死亡细胞数量比模型组明显减少(P<0. 05);高剂量组活细胞比模型组明显增多(P<0. 05),低剂量组活细胞数量比模型组增多但无统计学意义(P>0. 05);高剂量组和低剂量组晚期凋亡细胞数量比模型组没有明显增多(P>0. 05),高剂量组其早期凋亡细胞数量显著减少,与模型组比较均有显著差异(P<0. 05)。其他细胞与模型组比较无统计学意义(P>0. 05),见表1。

表1 各组动脉平滑肌细胞的凋亡变化(x±s,%,n=6)

2. 2菟丝子总黄酮对血管平滑肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达影响模型组Bax蛋白表达升高和Bcl-2蛋白表达显著下降,与正常组比较有统计学差异(P<0. 05)。菟丝子总黄酮高剂量组Bax蛋白表达量下降与模型组比较有统计学差异(P<0. 05),而Bcl-2蛋白表达升高,但无显著差异(P>0. 05);菟丝子总黄酮低剂量组Bax蛋白表达量下降但无显著性差异(P>0. 05),而Bcl-2蛋白表达量显著性升高,与模型组比较有统计学差异(P<0. 05);菟丝子总黄酮高、低剂量组之间无显著差异,见表2和图1。

表2 各组血管平滑肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达变化(x ±s,n=6)

2. 3菟丝子总黄酮对血管平滑肌细胞C-myc mRNA表达模型组C-myc mRNA表达(1. 07±0. 06)显著下降,与正常组(1. 16±0. 08)比较有统计学差异(P<0. 05),菟丝子总黄酮高剂量组C-myc mRNA表达量(1. 11±0. 04)显著升高,与模型组比较有统计学差异(P<0. 05),菟丝子总黄酮低剂量组C-myc mR-NA表达量(1. 13±0. 05)显著升高,与模型组比较有统计学差异(P<0. 05),但菟丝子总黄酮高、低剂量组无显著差异(P>0. 05),无剂量依从效应。

图1 各组Bcl-2和Bax蛋白变化

3 讨论

细胞凋亡是多种基因参与的复杂分子调控机制,Bcl-2原癌基因是目前最受关注的凋亡相关基因之一,通过编码Bcl-2蛋白而发挥抗凋亡作用。Bcl-2蛋白可以通过抗氧化作用减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成。还可以通抑制细胞膜通道的形成,稳定线粒体膜电位,而阻止细胞色素C从线粒体中的释放,保护细胞膜稳定细胞〔5〕。Bcl-2蛋白的BH3结构域与促凋亡Bax,Bak基因形成异二聚体,从而维持促凋亡成员在细胞内的定位分布,保护细胞不进入凋亡程序〔6〕。

体内外实验均发现氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)促进血管平滑肌细胞的凋亡。ox-LDL将平滑肌细胞阻滞在G2/M期从而诱导其凋亡,是通过调节细胞G蛋白偶联受体,与Ras/Raf/MEK/MAPK通路有关〔7〕。本实验提示其能促进平滑肌细胞的凋亡,菟丝子总黄酮能改善抗凋亡和促凋亡蛋白失衡。

温补肾阳的中药——菟丝子具有对实验性大鼠心肌缺血有明显的预防和治疗作用,可减轻心肌缺血的程度和范围,并且增加冠状动脉流量、扩冠、降压以及强心等作用〔8〕。本课题组前期研究表明,菟丝子总黄酮有促进机体内源性雌激素的产生,菟丝子总黄酮高、低剂量能明显降低血脂中TG水平,能提高主动脉平滑肌细胞的雌激素受体阳性表达,提示菟丝子总黄酮通过调整血脂代谢、增加内源性雌激素水平及增加血管平滑肌雌激素受体发挥其对血管的保护作用〔9〕。

C-myc基因是细胞进化过程中保守的癌基因家族myc基因家族的重要成员之一,3个外显子和2个内含子组成,编码49 kD核内磷酸化的蛋白质,以调节基因转录。既是一种可使细胞无限增殖,促进细胞分裂的基因,也是调控细胞凋亡基因,可以诱导除去生长因子的平滑肌细胞和成纤维细胞发生凋亡。用C-myc与Bcl-2共同转染血管平滑肌细胞时,则诱导血管平滑肌细胞凋亡的活性被抑制〔10〕。本研究中菟丝子总黄酮可能通过升高C-myc基因表达,阻止血管平滑肌细胞凋亡。血管平滑肌凋亡效应是多个通路相互协调,形成一个信号网络共同完成的。本实验菟丝子总黄酮仅对抑制血管平滑肌细胞凋亡的分子机制做初步的探讨,对具体信号通路的影响尚有待进一步研究。

4参考文献

1 Debbis D,Tea BS,Than VD. Apoptosis and efferocytosis in mouse models of atherosclerosis〔J〕.Hypertension,1997; 29(4): 340-9.

2牛英才,潘志,李晓明,等.葛根异黄酮对MPP+诱导的PCL2细胞凋亡的保护作用〔J〕.中国药理学通报,2009; 25(1): 112-5.

3王晓敏,王建红,刘海云,等.菟丝子总黄酮对去势雌性大鼠血清中的雌激素水平和血管平滑肌细胞凋亡的影响〔J〕.天津医药,2005; 33(10): 650-2.

4王建礼,徐兴华,司艳红,等.蜂胶水提物对氧化型低密度脂蛋白诱导的平滑肌细胞凋亡的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志,2011; 19(3): 202-5.

5郭峰.血管平滑肌细胞凋亡机制的研究进展〔J〕.心血管病学进展,2006; 27(2): 218-20.

6 Sukhotnik I,Voskoboinik K,Lurie M. Involvement of the bax and bcl-2 system in the induction of germ cell apoptosis is correlated with the time of reperfusion after testicular ischemia in a rat model〔J〕.Fertil Steril,2009; 46(4): 1466-9.

7 Jing Q,Xin SM,Cheng ZJ,et al.Activation of p38 milogen-activated kinase by oxidize LDL in vascular smooth muscle cells〔J〕.Circulation,1999; 84(7): 831-9.

8李连达.菟丝子总黄酮对实验性心肌缺血及心脏血流动力学的影响〔J〕.中国药理通讯,1984; 11(3): 14-6.

9王晓敏,王建红,邹志坚,等.菟丝子总黄酮对去势雌性大鼠血脂和血管雌激素受体的影响〔J〕.中成药,2008; 30(2): 255-6.

10 Stoneman VE,Bennett MR.Role of apoptosis in athero-sclerosis and its therapeutic implications〔J〕.Clin Sci,2004; 107(4): 343-54.

〔2014-06-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者:谢斌(1975-),男,博士,副教授,硕士生导师,主要从事中医药防治心血管疾病研究。

基金项目:江西省自然基金课题(2008GZY0018)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5742-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 026

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R285

第一作者:王晓敏(1972-),男,博士,副教授,硕士生导师,主要从事中医药防治心血管疾病研究。

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