环氧合酶-2抑制剂降低结肠癌细胞血管内皮生长因子表达的影响及机制

韩　冰　(沈阳医学院附属中心医院消化内科，辽宁　沈阳　110024)



环氧合酶-2抑制剂降低结肠癌细胞血管内皮生长因子表达的影响及机制

韩冰(沈阳医学院附属中心医院消化内科，辽宁沈阳110024)

〔摘要〕目的探讨选择性环氧合酶(COX)-2抑制剂celecoxib影响结肠癌HT-29细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的机制。方法体外培养结肠癌HT-29细胞，采用MTT法检测celecoxib对HT-29细胞增殖的影响。同时针对Sp1和Sp4进行RNA干扰，应用RT-PCR和Western印迹法联合检测celecoxib组和干扰组对HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白表达的影响。结果随着药物浓度的增加(5、10、20、40和80 μmol/L)和作用时间的延长(2、4、8、16和32 h)，celecoxib对HT-29细胞的增殖具有显著抑制作用，在2、4、8、16和32 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为40. 36、33. 15、31. 67、30. 94和31. 54 μmol/L。RT-PCR和Western印迹检测显示，celecoxib可显著降低HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白的表达水平，同时经RNA干扰Sp1(Sp4)后，HT-29细胞Sp1(Sp4)和VEGF mRNA和蛋白的表达水平明显降低，但Sp4(Sp1)mRNA和蛋白表达变化不明显。结论celecoxib可抑制结肠癌HT-29细胞增殖，其作用机制可能是通过下调Sp1和Sp4表达水平而降低结肠癌细胞中VEGF的表达水平。

〔关键词〕环氧合酶-2;结肠癌; Sp1; Sp4;血管内皮生长因子(VEGF)

结肠癌以淋巴道转移为主，发病率较高且较早，由于缺乏特异、敏感的诊断和生物防治的指标与方法，发现时往往为中晚期，生存率为33%。环氧合酶(COX)是花生四烯酸代谢过程中一个重要的限速酶，其中COX-2是前列腺素合成的限速酶，在正常组织中检测不到，而在炎症和肿瘤中表达量迅速增高，被认为与肿瘤的发生和发展密切相关〔1〕。作为COX-2的选择性抑制剂，非甾体类抗炎药塞来昔布(celecoxib)可以抑制多种肿瘤细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而抑制肿瘤的形成、转移和浸润〔2，3〕。本研究观察celecoxib对结肠癌细胞Sp1、Sp4和VEGF表达的影响及机制。

1　材料与方法

1. 1材料人结肠癌HT-29细胞系购自中国科学院上海细胞生物研究所;胎牛血清和McCoy 5A培养基购自Gibco公司;青霉素和硫酸链霉素购自美国Sigma公司; CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所; Trizol和lipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司;细胞蛋白提取试剂盒购自碧云天生物有限公司;反转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTM购自TAKARA公司;辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG购自北京鼎国昌盛有限公司; β-tubulin、Sp1、Sp4和VEGF抗体购自Abcam公司。

1. 2细胞培养HT-29细胞用含10%灭活胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml硫酸链霉素的McCoy 5A细胞培养液培养，调整合适浓度加到细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱，1～2 d换液，待培养瓶内细胞生长至80%后备用。

1. 3细胞增殖活性分析将1×104的HT-29细胞接种于96孔细胞培养板中培养24 h，实验组(添加终浓度5、10、20、40、80 μmol/L的celecoxib)，同时设对照组，每组重复3孔。分别于2、4、8、16、32 h后，加MTT液(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养4 h，吸弃上清液，加入150 μl/孔二甲基亚砜(DMSO－)振荡混匀10 min，使蓝紫色沉淀充分溶解，选择490 nm波长，在全自动酶标仪上测定吸光度A值，实验重复3次。平均细胞生长抑制率(%)=(1－A实验组/A对照组)×100%。

1. 4 siRNA的设计、合成与转染根据美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中Sp1和Sp4基因序列及相关文献报道设计针对Sp1和Sp4 siRNA〔4〕，引物序列，Sp1正义链5'-AUCACUCCAUGGAUGAAAUGATT-3'，反义链5'-UCAUUUCAUCCAUGGAGUGAUTT-3'。Sp4正义链5'-GCAGUGACACAUUAGUGAGCTT-3'，反义链5'-GCUCACUAAUGUGUCACUGCTT-3'。均由生工生物工程(上海)有限公司合成。HT-29细胞按2×105个/孔接于24孔板中，细胞生长至80%后利用lipofectamineTM2000转染siRNA至HT-29细胞，使siRNA终浓度达到50 nmol/L。置于37℃，5%CO2细胞培养箱培养24 h。

1. 5 RT-PCR检测细胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA的表达收集各处理组细胞，利用Trizol法提取各处理组细胞总RNA，以Gapdh为内参，二步法RT-PCR检测Sp1、Sp4和VEGF mRNA的表达。引物序列，VEGF正义链5'-CCATGAACTTTCTGCTGTCTT-3'，反义链5'-ATCGCATCAGGGGCACACAG-3'; Sp1正义链5'-GGAGTTGGTGGCAATAATGGG-3'，反义链5'-TGGTTCTGTAAGTTGGGAGCGG-3'; Sp4正义链5'-CCAGCAGTAATAACGGGAGTGC-3'，反义链5'-AAGTAGTGGTGTTGGTGGGTGTG-3'; Gapdh正义链5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3'，反义链5'-GTCATCATATTTGGCAGGTT-3'。各引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。25 μl反应体系为: 2×SYBR®Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)12. 5 μl;上、下游引物各0. 5 μl; 50×ROX Reference DyeⅡ1 μl; DNA模板2 μl;补充灭菌超纯水至25 μl。反应条件为: 95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，共40个循环; 72℃延伸10 min; 95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，循环1次得到溶解曲线。

1. 6 Western印迹法检测细胞Sp1、Sp4和VEGF蛋白的表达收集各处理组细胞，利用细胞蛋白提取试剂盒提取细胞内总蛋白，经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用3. 7%脱脂奶粉4℃封闭过夜，封闭结束后，向转移膜滴加抗体(用封闭液1∶400稀释鼠源单克隆抗体:β-tubulin、Sp1、Sp4和VEGF)，室温孵育2 h。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3次，每次5 min。辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(封闭液1∶5 000稀释)室温孵育1 h。孵育结束后，取出膜用PBST洗涤3次，每次5 min。采用增强化学发光法(ECL)显色。

1. 7统计学分析采用SPSS19. 0统计学软件进行t检验。

2　结果

2. 1 celecoxib对HT-29细胞增殖抑制作用各种剂量组celecoxib在各个时间点对HT-29细胞增殖具有一定的抑制作用。同时，这种抑制作用具有时间依赖性，除5 mg/L剂量组外，其他各剂量组随作用时间的延长，抑制作用增强，虽然有时处于平稳抑制作用或呈下降趋势，但这种变化并没有显著差异。celecoxib对HT-29细胞增殖的抑制作用也具有明显浓度依赖性，从5 μmol/L起对HT-29细胞增殖的抑制效应逐渐显著增加。见表1。celecoxib在2、4、8、16、32 h时的半数抑制浓度IC50分别为40. 36、33. 15、31. 67、30. 94、31. 54 μmol/L。

2. 2 HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白表达的变化celecoxib可显著降低HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA和蛋白的表达，同时RNA干扰Sp1后，HT-29细胞Sp1和VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低，但Sp4 mRNA和蛋白表达不变，而RNA干扰Sp4后，HT-29细胞Sp4和VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低，但Sp1 mRNA和蛋白表达不变。同时发现，celecoxib组VEGF mRNA和蛋白的表达降低程度明显高于Sp1和Sp4 RNA干扰组，但Sp1 RNA干扰组和Sp4 RNA干扰组之间VEGF mRNA和蛋白的表达降低程度没有差异。见表2和图1。

表1　不同剂量celecoxib对HT-29细胞增殖的抑制作用(x±s，%)

表2　不同处理HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF mRNA表达的变化(x±s)

图1　不同处理HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF蛋白表达的变化

3　讨论

美国2007年的统计表明，结肠癌是排在第三位的最常见肿瘤，每年大约有11. 234万人新发病，其中有5. 218万人死亡，而结肠癌在我国已由10年前列恶性肿瘤的第6位上升到目前的第4位〔5〕。转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，被认为是肿瘤难以治愈的首要因素之一。结肠癌的局部淋巴结转移是最常见的现象，常导致患者治疗效果不佳，虽然对于淋巴结转移的具体机制尚不清楚，但肿瘤淋巴管的生成不仅是肿瘤生长所必需的，而且也被认为是肿瘤细胞向远处转移的助推器。

肿瘤淋巴管的生长是肿瘤细胞诱导的毛细血管生长及肿瘤血液循环建立的过程，此过程涉及多种促血管生成因子、抑制因子、酶类和细胞黏附因子。其中VEGF是最早发现，也是目前为止发现的最具特异性的淋巴管内皮生长刺激因子。VEGF 是VEGF家族中的一员，被认为是重要的促淋巴管生长因子，正常组织情况下，VEGF表达水平相对较低，但在炎症和肿瘤等某些病理情况下，VEGF在许多肿瘤组织中呈过量表达状态。VEGF在许多肿瘤新生血管形成中起着关键作用，与肿瘤的浸润、淋巴道转移和预后显著相关，可能成为临床干预与治疗的新靶点〔6〕。本研究也表明VEGF在结肠癌HT-29细胞中高表达。

COX有两种异构酶，其中COX-1是结构酶，存在于大多数细胞和组织中。COX-2为诱导酶，存在于多种组织与细胞中，但在正常生理状态下很少表达，在组织损伤和炎症等及肿瘤发生发展过程中，可以迅速地被诱导、表达增强。目前认为COX-2可通过多种途径促进肿瘤血管的生成。COX-2在绝大多数人类肿瘤中过表达，而且其过表达与结肠癌、头颈部肿瘤、肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤的浸润、淋巴结转移和预后不良有关〔7〕。COX-2表达增强在消化系统则被认为是癌症发生过程中的早期事件，其致癌机制主要包括促进细胞增殖、抑制凋亡、增加肿瘤细胞侵袭力及促进肿瘤血管生成。研究显示，COX-2抑制剂可抑制多种肿瘤细胞的生长，与许多抗肿瘤药物具有协同抗肿瘤作用〔8〕。本研究中，COX-2抑制剂celecoxib能显著抑制结肠癌HT-29细胞的增殖，这种抑制作用具有浓度和时间依赖性。

将表达COX-2大肠癌细胞与内皮细胞联合培养，可诱导大肠癌细胞产生的VEGF以旁分泌的形式作用于内皮细胞，促进内皮细胞迁移及管样结构的形成，同时这一过程可被选择性COX-2抑制剂及VEGF抗体抑制。本研究结果说明COX-2与肿瘤中的VEGF表达密切相关。虽然许多研究证实了它们之间存在调节关系，但具体机制却依然不清楚〔9〕。本研究表明celecoxib可通过下调Sp1和Sp4蛋白以降低结肠癌细胞中的VEGF的表达水平，从而起到抑制结肠癌细胞增殖的作用。

4参考文献

1卢丽娜，杨婷，庄则豪.环氧合酶及其抑制剂与肿瘤防治的研究进展〔J〕．中国临床药理学与治疗学，2006; 11(1): 22-6.

2谢传高，王兴鹏，董育玮，等.选择性环氧合酶-2抑制剂Celebrex对胰腺癌血管内皮生长因子表达的影响〔J〕．癌症，2003; 22(10): 1042-6.

3胡均，王敏，程旋，等.选择性环氧合酶-2抑制剂Celebrex对人胆囊癌GBC-SD细胞系VEGF表达的影响〔J〕．华中科技大学学报(医学版)，2007; 36(5): 607-9，619.

4 Abdelrahim M，Safe S. Cyclooxygenase-2 inhibitors decrease vascular endothelial growth factor expression in colon cancer cells by enhanced degradation of Sp1 and Sp4 proteins〔J〕．Mol Pharmacol，2005; 68(2): 317-29.

5 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al．Cancer statistics，2007〔J〕．CA Cancer J Clin，2007; 57(1): 43-66.

6陈建华.结肠癌及癌前病变组织中COX-2及VEGF的表达〔J〕．世界华人消化杂志，2007; 15(19): 2167-9.

7 Cervello M，Foderaa D，Florena AM，et al．Correlation between expression of cyclooxygenase-2 and the presence of inflammatory cells in human primary hepatocellular carcinoma: possible role in tumor promotion and angiogenesis〔J〕．World J Gastroenterol，2005; 11(1): 4638-43.

8 Ponthan F，Wickstrlm M，Gleissman H，et al．Celecoxib prevents neuroblastoma tumor development and potentiates the effect of chemotherapeutic drugs in vitro and in vivo〔J〕．Clin Cancer Res，2007; 13(3): 1036-44.

9邹发长.结肠腺癌组织中COX-2与VEGF-C表达及意义〔J〕．现代预防医学，2010; 37(2): 326-7.

〔2014-11-07修回〕

(编辑杜娟)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5721-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 017

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R574. 6

第一作者:韩冰(1975-)，女，主治医师，主要从事胃肠病研究。