枸杞多糖胶囊对小鼠急性毒性的影响

赵　蕊　张　涛蔡亚平　邵星月陈志宝　阮洪生　葛文中　郑小亮(黑龙江八一农垦大学生命学院，黑龙江　大庆　6339)



枸杞多糖胶囊对小鼠急性毒性的影响

赵蕊张涛1蔡亚平邵星月2陈志宝阮洪生葛文中郑小亮
(黑龙江八一农垦大学生命学院，黑龙江大庆163319)

〔摘要〕目的观察小鼠口服枸杞多糖胶囊的毒性反应。方法采用一次最大限量法给药测定小鼠口服枸杞多糖胶囊的急性毒性;以枸杞多糖胶囊高剂量组(10 g·kg－1·d－1)、中剂量组(5 g·kg－1·d－1)、低剂量组(2. 5 g·kg－1·d－1)，灌胃小鼠，连续24 w，观察小鼠的体重、血液学、血液生化学、组织病理指标的变化。小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸形试验对枸杞多糖胶囊进行安全性评价。结果枸杞多糖胶囊最大给药浓度20g/kg时，小鼠未见毒性反应。各给药组小鼠体重与对照组比较，无统计学差异(P＞0. 05)。不同剂量的枸杞多糖胶囊对小鼠血液学、生化学指标、脏器形态学、小鼠骨髓细胞微核率及小鼠精子畸形率的影响均未见异常。结论枸杞多糖胶囊无毒且未见遗传毒性作用。

〔关键词〕枸杞多胶囊;毒性

1佳木斯大学基础医学院2大庆油田总医院

第一作者:赵蕊(1975-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事中药药理毒理学研究。

枸杞多糖具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗肾衰老等作用〔1～3〕。实验证明，枸杞多糖能有效治疗二型糖尿病并确定其机制〔4～6〕。本研究制备枸杞有效成分多糖，并制成胶囊研究其毒理学。

1　材料与方法

1. 1材料昆明种小鼠，18～22 g，雌雄各半。枸杞多糖胶囊，由本实验室提供，实验前将胶囊内药粉用蒸馏水配制成各剂量组灌胃所需浓度的悬浮液。仪器:日立7020全自动生化分析仪(日本); SWELABAC920EO自动血球计数仪(瑞典)。

1. 2方法

1. 2. 1小鼠口服急性毒性实验由于预实验测不出LD50，故采用一次最大限量法，清洁级健康昆明小鼠40只，雌、雄各半，小鼠观察30 d，适应实验环境。禁食不禁水12 h后，随机挑选20只(雌、雄各半)按20 g/kg，0. 4 ml/10 g经口一次给药，另20只给予同体积的蒸馏水，连续观察7 d，记录小鼠的中毒症状及死亡情况。

1. 2. 2小鼠长期毒性实验实验前将小鼠观察1 w，适应实验环境。随机分为四组，空白对照组、枸杞多糖胶囊高剂量组(10 g·kg－1·d－1)、中剂量组(5 g·kg－1·d－1)、低剂量组(2. 5 g·kg－1·d－1)，每组30只，雌雄各半。每天灌胃给药10 ml/kg，空白对照组灌服等体积生理盐水，连续灌胃24 w。给药前及给药期间每周称动物体重1次，并根据体重变化调整给药体积。观察指标:①一般情况:给药期间每天定时观察小鼠外观体征、行为活动和粪便情况，并作记录;每2 w测定体重1次，直至给药结束;②血液学检查:白细胞数(WBC)、淋巴细胞数(LYM)、红细胞数(RBC)、粒细胞数(GRAN)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT);③血液生化检查:在停药后断头取血测定血液生化指标，包括血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)的含量;④重要器官病理学检查:给药结束时对实验小鼠进行解剖检查，肉眼观察各主要脏器大小、颜色、硬度、表面光滑情况及胸腔有无积液;取肝和肾，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋后切片，HE染色镜检，观察有无萎缩、变性、坏死、炎细胞浸润、变质、渗出和增生等病理学变化。

1. 2. 3小鼠骨髓微核试验雌、雄昆明种小鼠各35只，随机分为五组。各分为空白组、阳性药组(0. 04 g/kg，环磷酰胺)、枸杞多糖胶囊高剂量组(10 g·kg－1·d－1)、中剂量组(5 g·kg－1·d－1)、低剂量组(2. 5 g·kg－1·d－1)。灌胃给药，灌胃量0. 4 ml/20 g，初次给药后，间隔24 h给药，末次给药后6 h处死动物。解剖小鼠股骨，用小牛血清冲洗骨髓腔，制成细胞混悬液涂片，自然干燥。涂片甲醇固定5 min，Giemsa应用液染色15 min，用磷酸缓冲液冲洗涂片，自然干燥后阅片。

1. 2. 4小鼠精子畸形试验雄性昆明种小鼠25只，分组及给药同1. 2. 2，其中空白组给予0. 5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。连续给药五天，第35天处死动物，解剖出小鼠两侧附睾置于2 ml生理盐水中，纵剪1～2刀，轻摇，静置5 min。四层擦镜纸滤过，滤液涂片，自然干燥。涂片甲醇中固定5 min，自然干燥后2%伊红染色1 h，蒸馏水清洗涂片。自然干燥后阅片。

1. 3统计学处理采用SPSS11. 0统计软件行单因素方差分析及χ2检验。

2　结果

2. 1小鼠急性毒性实验结果连续观察7 d，小鼠无死亡现象，小鼠给药后无不安等异常反应，运动协调，分泌物无增多现象，皮毛干净整洁。解剖观察小鼠各脏器重量质地颜色均无异常。表明枸杞多糖胶囊对雌、雄小鼠基本安全无毒。

2. 2小鼠长期毒性实验结果给药24 w后，小鼠无死亡。各组小鼠的自主活动、饮水、摄食、排泄等均未见异常。各给药组小鼠体重分别与空白对照组体重比较，均无统计学差异(P＞0. 05)。见表1。各给药组小鼠血液学、生化学指标与空白对照组比较，差异不显著(P＞0. 05)，并且均在正常值范围。见表2，表3。肉眼观察心、肝、脾、肺和肾等主要脏器，未见组织有异常改变。病理组织学检查小鼠肝和肾发现小部分肝、肾细胞水肿，空白组和枸杞胶囊各组之间差异无统计学意义，表明枸杞胶囊没有明显毒性作用，可能由于动物自身或其他原因所致。

2. 3枸杞多糖胶囊对肝、肾组织影响各组小鼠肝脏小叶结构清楚，细胞形态正常，未见明显变性及坏死(图1);各组小鼠肾脏皮质髓质界限清楚，肾小球清晰可见，髓质及乳头部未见明显改变(图2)。

2. 4枸杞多糖胶囊对小鼠精子畸形率的影响阳性药组小鼠的精子畸形率与空白组小鼠相比有极显著差异。三个剂量组的枸杞多糖胶囊与空白组相比无显著差异。不同剂量的枸杞多糖胶囊，对小鼠精子畸形率的影响无显著差异。见表4。

表1　枸杞多糖胶囊对长期毒性实验小鼠体重的影响(x ±s，n=30，g)

表2　枸杞多糖胶囊对长期毒性实验小鼠血液学指标的影响(x±s，n=30)

表3　枸杞多糖胶囊对长期毒性实验小鼠生化学指标的影响(x±s，n=30)

图1　枸杞多糖胶囊对肝组织影响(HE，×200)

2. 5枸杞多糖对小鼠骨髓细胞微核率的影响阳性药组与空白组有显著差异(P＜0. 01)。枸杞多糖胶囊各剂量组与空白组相比，无统计学差异(P＞0. 05)。不同剂量的枸杞多糖胶囊对小鼠微核率的影响无统计学差异(P＞0. 05)。见表5。

表4　枸杞多糖胶囊对小鼠精子畸形率的影响(x ±s，n=7)

表5　枸杞多糖胶囊对小鼠骨髓细胞微核率的影响(x±s，n=7)

图2　枸杞多糖胶囊对肾组织影响(HE，×200)

3　讨论

急性毒性研究表明，在枸杞多糖胶囊的最大给药浓度20 g/kg时，小鼠未见毒性反应，说明小鼠的最大耐受量＞20 g/kg，为实际无毒物质。本实验结果说明枸杞多糖胶囊对动物血液和主要代谢排泄器官无明显毒性。微核是在有丝分裂后期，没有进入子细胞细胞核的单染色体或染色体片段形成的。小鼠微核率的提高，提示染色体受到染色体断裂剂或纺锤体毒物作用的影响。本研究中，枸杞多糖胶囊组雌、雄性小鼠的微核率与空白对照组无显著性差异。枸杞多糖胶囊对小鼠微核率的影响与性别无关联性，提示枸杞多糖胶囊对哺乳动物体细胞畸变率无影响。哺乳动物精子的形态受基因的控制，精子形态发生改变提示哺乳动物可能受到外界致突变作用的影响。正常情况下，哺乳动物也有一定的自发精子畸形率，但在受到外界致畸条件影响时，就会引起精子畸形率的大幅度提高。本研究提示，枸杞多糖无致小鼠精子畸形作用，与微核试验的结果一致。综上，根据《保健食品安全性毒理学评价规范》的要求，经过第一阶段急性毒性研究和第二阶段的遗传毒性研究，表明枸杞多糖胶囊属实际无毒物质，对哺乳动物无遗传毒性，临床应用安全。

4参考文献

1方建国，丁水平，田庚元.枸杞多糖药理作用与临床应用〔J〕．医药导报，2004; 23(7): 484-5.

2梅全喜，毕焕新.现代中医药理手册〔M〕．北京:中国中医药出版社，1998: 585-7.

3刘晓梅，韩宁，金维哲，等.枸杞抗肾脏衰老作用的形态学定量研究〔J〕．中国老年学杂志，2004; 24(2): 132-3.

4赵蕊，李青旺，张冰梅.枸杞多糖-4a改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用的研究〔J〕．中国畜牧兽医，2009; 36(9): 37-41.

5 Zhao R，Li QW，Li J，et al．Protective effect of Lycium barbarum polysaccharide 4 on kidneys in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕．Can J Physiol Pharm，2009; 87(9): 711-9.

6 Zhao R，Li QW，Xiao B. Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the improvement of insulin resistance in NIDDM rats〔J〕．YAKUGAKU ZASSHI，2005; 125(12): 981-8.

〔2014-09-19修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目:大庆高新区科技专项资金项目(DQGX2011kj035)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5714-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 014

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R283. 6