曲美他嗪干预对心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体超微结构、心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白、细胞色素C蛋白表达的影响

冯翔宇，赵亮，冯佩明，李秀华

曲美他嗪干预对心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体超微结构、心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白、细胞色素C蛋白表达的影响

冯翔宇，赵亮，冯佩明，李秀华

目的：探讨曲美他嗪干预对心力衰竭（心衰）大鼠左心室心肌细胞线粒体超微结构、心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白和细胞色素C蛋白表达的影响。

方法：雄性wistar大鼠30只随机分为假手术组、心衰模型组、曲美他嗪组，每组10只。除假手术组外，其余两组大鼠采用肾上腹主动脉缩窄法建立慢性心衰模型，其中曲美他嗪组大鼠给予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃4 w。观察各组左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室压力最大上升及下降速率（±dp/dtmax）；苏木素伊红（HE）染色法观察大鼠心肌细胞形态结构；透射电镜观察心肌细胞线粒体超微结构；原位缺口末端标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡指数（AI）；SP免疫组织化学法检测各组大鼠左心室心肌细胞caspase-3蛋白、细胞色素C蛋白的表达。

结果：与假手术组比较，心衰模型组大鼠心肌细胞线粒体形态发生明显改变，排列紊乱，空泡变性，LVEDP显著升高（P＜0.01），±dp/dtmax明显降低（P＜0.01），心肌细胞凋亡指数、caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白的表达水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与心衰模型组相比，曲美他嗪组大鼠心肌细胞线粒体形态变化明显改善，LVEDP明显下降（P＜0.01），±dp/dtmax显著升高（P＜0.01），心肌细胞凋亡指数、caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白的表达水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

结论：曲美他嗪可有效改善心功能，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能与保护心肌细胞线粒体功能有关。

心力衰竭；细胞凋亡；线粒体； caspese-3蛋白；细胞色素C蛋白

Methods: A total of 30 male Wister rats were randomly divided into 3 groups: Sham group, the rats received operation without constriction, followed by intragastric administration of normal saline, n=10; the rest animals received suprarenal aortic constriction to establish HF model and further divided into 2 group: HF model group, the rats received intragastric administration of normal saline and Trimetazidine group, the rats received intragastric administration of timetazidine at 10 mg/(kg·d). n=10 in each group, all animal were treated for 4 weeks. Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) and the maximum left ventricular pressure rising and falling (±dp/dtmax) were measured. The morphology of myocardium was observed by HE staining, myocardial ultra-structure was examined by transmission electronic microscopy, apoptotic index (AI) was detected by TUNEL assay. The expressions of caspase-3 and cytochrome C were evaluated by immunohistochemistry.

Results: Compared with Sham group, the rats in HF model group showed the morphological changes of myocardial mitochondria as disordered structure with vacuolar degeneration; increased LVEDP, P＜0.01 and decreased (±dp/dtmax),

P＜0.01; elevated AI and the expressions of Caspase-3, Cytochrome C, P＜0.01. Compared with HF model group, the rats in Trimetazidine group presented obviously improved myocardial mitochondrial morphology, much lower LVEDP, P＜0.01 and higher (±dp/dtmax), P＜0.01; reduced AI and the expressions of Caspase-3, Cytochrome C, P＜0.01.

Conclusion: Trimetazidine may effectively improve cardiac function and inhibit cadiomyocyte apoptosis, which might be related to the protection of mitochondrial function in experimental HF rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:276.)

心力衰竭（心衰）作为各种心脏病的终末阶段，其发生发展中存在着心肌缺血及凋亡事件，这些都与心肌代谢密切相关[1,2]。曲美他嗪是一种改善心肌代谢的药物，主要用于抗心绞痛的治疗。目前研究表明，曲美他嗪在治疗心衰中可有效干预心肌能量代谢，抑制心肌细胞凋亡[3]，但其具体作用机制，亟需进一步探讨。本实验通过缩窄大鼠肾上腹主动脉建立慢性心衰模型，探讨曲美他嗪干预对心衰大鼠心肌细胞线粒体超微结构、心肌细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白、细胞色素C蛋白表达的影响。

1 材料与方法

材料：本实验于2013-01至2014-01选取清洁级雄性Wistar大鼠30只购自北京华阜康生物科技股份有限公司（合格证编号：2009-0004）；盐酸曲美他嗪（瑞阳制药有限公司）；原位缺口粒端标记（TUNEL）法试剂盒（美国罗氏公司）；caspase-3兔抗多克隆抗体（武汉博士德公司）；细胞色素C蛋白兔抗多克隆抗体（美国Santa cruz公司），SP免疫组织化学试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）。

实验动物分组、模型建立：清洁级雄性Wistar大鼠30只，200～230 g，适应性喂养1 w后，按随机数字随机分为假手术组、心衰模型组、曲美他嗪组，每组10只。利用肾上腹主动脉缩窄手术处理心衰模型组和曲美他嗪组大鼠复制慢性心衰模型[4,5]。制作步骤：将三组大鼠均用3%戊巴比妥钠0.15 ml/100 g腹腔注射麻醉，剪毛后在腹部剑突下沿正中线切开皮肤2～3 cm，分层切开腹腔，分离出的腹主动脉，用“0”号丝线穿过左肾动脉上方，用丝线将腹主动脉和磨钝的7号手术针一同结扎，注意松紧度，然后抽出手术针，确定腹主动脉通畅后分层关腹。假手术组大鼠只分离腹主动脉不予结扎。各组大鼠术后均给予20万单位青霉素腹腔注射，连续给药3天。

模型成功标准及处理方案：常规喂养4 w后，心衰模型组和曲美他嗪组大鼠逐渐出现精神萎靡、食欲减退、体重增长缓慢、脱毛等表现，测血流动力学参数时造模成功的标准为左心室舒张末期压（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。造模成功后曲美他嗪组大鼠每天给予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃，心衰模型组及假手术组给予等量生理盐水灌胃，连续4 w[6,7]。

血流动力学监测：至各大鼠实验8 w后将大鼠测体重后，按0.15 ml/100 g给予3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经右颈总动脉逆行插管至左心室，接通压力换能器输入多媒体生物信号记录仪系统，监测大鼠LVEDP，左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。

标本留取：每组随机抽去2只取左心室前壁1 mm×1 mm×1 mm大小的组织2～3块，先用2.5%戊二醛固定，再用1%锇酸后固定，用于透射电镜观察。取各组剩余8只大鼠部分左心室固定在4%多聚甲醛中留待石蜡包埋用于苏木素伊红（HE）染色、TUNEL法、免疫组织化学法检测。

形态学观察：HE染色观察各组大鼠心肌细胞的大体结构；透射电镜观察心肌细胞线粒体超微结构变化。

TUNEL法检测心肌凋亡指数（AI）：用TUNEL法，二氨基联苯胺（DAB）显色液显色，细胞核染成棕褐色为阳性细胞。在高倍视野（×400）下每个标本随机观察6个视野，计算细胞总数和阳性细胞数各取平均值，按公式：凋亡指数（AI）=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%，计算心肌细胞凋亡指数。

免疫组织化学法检测caspase-3蛋白和细胞色素C蛋白的表达情况:严格按免疫组化试剂盒步骤操作，抗体工作浓度均为1：50，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。caspase-3蛋白和细胞色素C蛋白阳性产物为分布于细胞质的棕黄色颗粒。用WiVnt图像分析系统对结果进行半定量分析，每个标本随机

观察4个高倍镜视野，用阳性产物面积/视野面积表示该抗原的相对含量，取其平均值。

统计学方法：采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析（One way ANOVE），两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血流动力学指标比较：与假手术组比较，心衰模型组和曲美他嗪组LVEDP显著升高（P＜0.01），±dp/dtmax明显降低（P＜0.01），差异有统计学意义；与心衰模型组比较，曲美他嗪组LVEDP明显下降（P＜0.01），±dp/dtmax显著升高（P＜0.01），差异有统计学意义。表1

表1 各组大鼠血流动力学指标比较

表1 各组大鼠血流动力学指标比较

注：与假手术组比较*P＜0.01；与心力衰竭模型组比较△P＜0.01。LVEDP：左心室舒张末压+dp/dtmax：左心室内压最大上升速率 -dp/dtmax：左心室内压最大下降速率。1 mmHg=0.133 kPa

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光学显微镜下HE染色各组大鼠心肌细胞形态改变：假手术组大鼠心肌细胞排列紧密、规则，形态正常，结构清晰，无炎细胞浸润；心衰模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌细胞部分肥大、水肿，结构模糊，可见炎细胞；曲美他嗪组大鼠心肌细胞介于其他两组之间，心肌改变较模型组有所改善。图1

图1 光学显微镜下苏木素伊红染色各组大鼠心肌细胞的形态改变（×400）

透射电镜下各组大鼠心肌细胞的超微结构改变：假手术组大鼠心肌细胞线粒体大小均匀，结构完整，线粒体嵴清晰完整，肌纤维排列整齐；心衰模型组大鼠心肌细胞线粒体大小不一，肿胀，可见空泡样变，结构不完整，部分线粒体嵴溶解断裂，肌纤维水肿，排列紊乱，甚者断裂；曲美他嗪组大鼠心肌细胞线粒体肿胀不明显，有变形，线粒体嵴排列稍紊乱，肌纤维排列较整齐，存在轻度溶解。图2

图2 透射电镜下各组大鼠心肌细胞的超微结构改变（×3000）

TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）：假手术组仅有少量凋亡细胞，心衰模型组和曲美他嗪组均较假手术组的凋亡细胞增多（P＜0.01），与心衰模型组比曲美他嗪组大鼠心肌凋亡细胞减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。表2、图3

免疫组织化学法检测各组大鼠心肌组织caspase-3蛋白和细胞色素C蛋白的表达：各组大鼠心肌细胞caspase-3蛋白与细胞色素C蛋白的阳性表达均为棕黄色颗粒，位于细胞质中。假手术组仅有少量caspase-3蛋白及细胞色素C表达。与假手术组比较，心衰模型组和曲美他嗪组大鼠心肌细胞的caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白表达明显增多颜色明显加深；与心衰模型组比较，曲美他嗪组大鼠心肌细胞的caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。表2、图4、图5

图3 TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡（×400）

图4 免疫组织化学二氨基联苯胺染色法检测各组大鼠心肌组织caspase-3蛋白的表达（×400）

图5 免疫组织化学二氨基联苯胺染色法检测各组大鼠心肌组织细胞色素C蛋白的表达（×400）

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡指数、caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白的表达

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡指数、caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白的表达

注：与假手术组比较*P＜0.01；与心力衰竭模型组比较△P＜0.01

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3 讨论

心肌细胞凋亡是心肌细胞内预存的死亡程序被某些刺激因子启动，在心衰的发生发展中起到重要作用，其中线粒体途径是一个非常重要的通路系统[8]。细胞色素C蛋白是启动线粒体介导的凋亡通路的关键因子，而caspase-3蛋白是各种凋亡路径级联反应中的关键因子，在线粒体途径凋亡途径中也具有重要作用[9]。研究表明，在一些凋亡刺激信号作用下，线粒体转运孔的孔径增大，使得线粒体的外膜被破坏，使本来存在于线粒体的细胞色素C蛋白释放到胞质当中[10]。细胞色素C蛋白可以与凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、caspase-9前体、dATP结合成凋亡复合体，使caspase-9活化，然后激活caspase-3蛋白，抑制DNA修复酶活性，激活细胞核的内切酶，切割DNA最终导致细胞凋亡[11]。

心衰时心肌细胞处于能量代谢重构状态，心肌能量代谢功能障碍最终加速心肌细胞凋亡导致心室重塑[2,12]。曲美他嗪作为影响心肌代谢类药物，可促使心肌细胞的代谢由游离脂肪酸β-氧化，向葡萄糖的有氧氧化转换，进而优化心肌能量代谢；与此同时，曲美他嗪可抑制氧自由基的产生、抑制Na+及Ca2+的超载、减轻细胞内酸中毒，保护细胞线粒体膜的稳定性[13,14]。

本实验研究，用曲美他嗪干预的心衰大鼠，观察各组大鼠的心功能、血液流变情况、线粒体超微结构、细胞凋亡指数及大鼠心肌细胞caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白的表达，来探讨曲美他嗪在心衰治疗中的作用机制。实验表明曲美他嗪可改善心衰大鼠的心功能，改善心肌细胞线粒体的病变，降低心肌细胞凋亡指数，下调心衰大鼠心肌细胞caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白的表达。

综上所述，曲美他嗪具有改善心功能，抑制细胞凋亡，延缓心衰的作用，其机制可能与改善心肌细胞线粒体形态结构，减少细胞色素C蛋白的表达，降低caspase-3蛋白的表达，减少细胞色素C释放，抑制caspase-3蛋白活性有关，其详细机制有待进一步探讨。

[1] 张武宁, 陈牧雷, 范谦, 等. 心肌细胞凋亡在老年性心衰发生中的作用. 中国心血管病研究杂志, 2012, 10: 297-301.

[2] 陈游洲, 袁建松, 乔树宾. 心力衰竭中能量代谢重构研究进展. 中国循环杂志, 2014, 4: 306-308.

[3] 高想, 张锋莉, 唐艳芬, 等. 曲美他嗪对大鼠心力衰竭模型心肌能量代谢的干预. 医学研究杂志, 2012, 41: 145-147.

[4] 李彪, 赵强, 许顶立, 等. β-3肾上腺素能受体激动对慢性心力衰竭大鼠心脏重构及血流动力学的影响. 中国循环杂志, 2013, 6: 455-457.

[5] 李秀华, 康大伟, 王莉, 等. 辛伐他汀与福辛普利对慢性心力衰竭大鼠心肌结缔组织生长因子的影响. 中华老年心脑血管病杂志, 2012, 14: 347-350.

[6] Mahfoudh-Boussaid A, Zaouali MA, Hauet T, et al. Attenuation of endoplasmic reticulum stress and mitochondrial injury in kidney with ischemic postconditioning application and trimetazidine treatment. J Biomedical Science, 2012, 19: 1-14.

[7] 李兵, 陈相健, 朱舒舒, 等. 曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢及超微结构的影响. 中华老年心脑血管病杂志, 2008, 10: 447-450.

[8] 高艳辉, 郑方方, 孔一慧, 等. 解偶联蛋白 2 与心力衰竭的关系.国际心血管病杂志, 2013, 40: 101-102.

[9] 杨泽栋, 李永东. 细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展. 医学综述, 2012, 18: 341-344.

[10] Florian L, Else KH. Role of ion transport in control of apoptotic cell death. Comprehensive Physiology, 2012, 2: 2037-2061.

[11] Cao X, Zhao S, Liu D, et al. ROS-Ca2+is associated with mitochondria permeability transition pore involved in surfactin-induced MCF-7 cells apoptosis. Chemico-Biological Interactions, 2011, 190: 16-27.

[12] Masoud WG, Clanachan AS, Lopaschuk GD. The failing heart: is it an inefficient engine or an engine out of fuel? Cardiac Remodeling, Springer, 2013. 5: 65-84.

[13] 赵志宏, 何并文. 曲美他嗪对心肌保护的研究进展. 医学综述, 2010, 16: 1074-1076.

[14] Fragasso G, Rosano G, Baek SH, et al. Effect of partial fatty acid oxidation inhibition with trimetazidine on mortality and morbidity in heart failure: results from an international multicentre retrospective cohort study. Int J Cardiol, 2013, 163: 320-325.

Effect of Trimetazidine on Myocardial Ultra-structure, Cardiomyocyte Apoptosis and Expressions of Caspase-3, Cytochrome C in Experimental Rats With Heart Failure

FENG Xiang-yu, ZHAO Liang, FENG Pei-ming, LI Xiu-hua.
Department of Geriatrics, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde (067000), Hebei, China

Objective: To investigate the effect of trimetazidine on myocardial ultra-structure, cardiomyocyte apoptosis, and expressions of caspase-3, cytochrome C in experimental rats with heart failure (HF).

Heart failure; Apoptosis; Mitochondrial; Caspase-3; Cytochrome C

2014-04-24）

（编辑：梅 平）

067000 河北省承德市，承德医学院附属医院 老年病科（冯翔宇、李秀华），神经内科（赵亮），超声科（冯佩明）

冯翔宇 硕士研究生 主要从事慢性心力衰竭的临床及病理生理研究 Email：fengxiangyu_1@126.com 通讯作者：李秀华

Email：Lixiuhua76@126.com

R541

A

1000-3614（2015）03-0276-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.019