核糖核酸干扰基质金属蛋白酶-3 基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响*

黄捷，冯艳，韩凌，李艳，张晶晶，宋昆鹏，石海莉

基础与实验研究

核糖核酸干扰基质金属蛋白酶-3 基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响*

黄捷，冯艳，韩凌，李艳，张晶晶，宋昆鹏，石海莉

目的：研究靶向大鼠基质金属蛋白酶-3基因的小干扰核糖核酸（siRNA）对血管平滑肌细胞增殖的影响。

方法：构建靶向自发性高血压大鼠基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的三对核糖核酸（RNA）干扰序列。将体外培养的血管平滑肌细胞随机分为对照组、Lipofectamine 2000（转染试剂）组、MMP-3-siRNA-1组、MMP-3-siRNA-2组、MMP-3-siRNA-3组，以Lipofectamine 2000 分别转染血管平滑肌细胞，48 h 后，以实时定量聚合酶链反应（PCR）检测血管平滑肌细胞MMP-3 信使核糖核酸（mRNA）的表达水平，筛选干扰效率最高的siRNA作为实验对象。血管平滑肌细胞随机分为4组：对照组、血小板源生长因子（PDGF） 组、Lipofectamine 2000+PDGF组及MMP-3-siRNA-1+PDGF组；用siRNA 转染体外培养的血管平滑肌细胞，以四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测血管平滑肌细胞增殖。

结果：实时定量PCR显示，三对互补干扰片段均有不同程度的干扰效果，与对照组比较，MMP-3-siRNA-1组、MMP-3-siRNA-2组和 MMP-3-siRNA-3组的mRNA水平明显降低，分别降低了81%、64%和22%。以MMP-3-siRNA-1组的干扰效率最高。蛋白免疫印迹法分析结果亦显示MMP-3-siRNA-1组的干扰效率最高。四甲基偶氮唑盐比色法检测吸光度值结果显示，与PDGF组相比，MMP-3-siRNA-1+ PDGF组转染能显著降低PDGF 诱导血管平滑肌细胞增殖的吸光度值，抑制率为36.1%（P＜0.05），差异有统计学意义。

结论：靶向MMP-3基因siRNA 序列，能显著降低平滑肌细胞MMP-3 mRNA和蛋白水平，抑制细胞增殖。靶向MMP-3基因干扰RNA可能成为血管增殖性疾病治疗的新靶点。

基质金属蛋白酶-3；血管平滑肌细胞； RNA干扰；增殖

Methods: There were 3 complementary targeting sequences of MMP-3 gene were established according to MMP-3 gene sequence in Genbank as MMP-3-siRNA-1, MMP-3-siRNA-2 and MMP-3-siRNA-3. The VSMCs were cultured in 5 groups: ①Control group, ②Lipofectamine2000 group, ③MMP-3-siRNA-1 group, ④MMP-3-siRNA-2 group and⑤MMP-3-siRNA-3 group. The cells were transfected with Lipofectamine2000 for 48 hours and the mRNA expression of MMP-3 was examined by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). The siRNA sequence with the highest interfering effciency was selected for further experiment, and VSMCs were divided in 4 groups: ①Control group, ②PDGF group,③Lipofectamine2000 + PDGF group and ④MMP-3-siRNA-1 + PDGF group. The cells were transfected with siRNA, and the proliferation of VSMC was detected by MTT method.

Results: qRT-PCR presented that 3 complementary sequences had different degrees of interfering effciency. Compared with Control group, the mRNA expressions of MMP-3 decreased in MMP-3-siRNA-1 group, MMP-3-siRNA-2 group and MMP-3-siRNA-3 group at 81%, 64% and 22% respectively. The MMP-3-siRNA-1 sequence had the highest interfering effciency and the same result was obtained by western blot analysis. Compared with PDGF group, MMP-3-siRNA-1 + PDGF group showed signifcantly decreased VSMC proliferation by 36.1%, P＜0.05.

Conclusion: The siRNA targeting sequence may decrease the mRNA and protein expression of MMP-3 and inhibit VSMC proliferation in experimental rats; it may become a new targeting point for treating the relevant vascular diseases.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:159.)

细胞外基质（ECM）异常积聚和降解引起血管损伤重构是动脉粥样硬化（AS）、冠心病及血管损伤再狭窄等血管增殖性疾病发生、发展的重要原因。基质金属蛋白酶（MMPs） 通过调节细胞外基质降解、促进中层血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移和增殖，从而在血管增殖性疾病的发生及发展过程中起重要的作用。本研究以血管平滑肌细胞为研究对象，利用核糖核酸（RNA）干扰技术，特异性地沉默MMP-3基因，观察其被沉默后对血管平滑肌细胞增殖的影响，以期为血管增殖性疾病的分子靶向治疗提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验的起止时间为2011-09 至2014-03。Lipofectamine 2000 （转染试剂）购自 Invitrogen（美国）； DMEM培养液和胎牛血清购自 Gibco（美国）；所用干扰序列由百奥迈科生物技术有限公司设计合成。四甲基偶氮唑盐（ MTT ）比色法细胞增殖试剂盒购自碧云天公司 ， 血小板源生长因子（PDGF） 购自美国 Peprotech 公司。兔抗大鼠抗体购自美国Santa Cruz公司，山羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

传统的教学模式，老师根据考试大纲划出重点内容，学生只需要背诵老师要求的重点即可。在课堂上，教师将花费大量的时间和精力来监督学生的学习，并督促学生按时完成指定的学习任务。课后还会安排很多功课，以巩固所学的知识。在这种模式中，老师成为了主体，学生一味地听从老师的安排与指导，这种模式虽然在应对考试时会有一定的成效，但是会导致学生缺乏判断能力以及自主学习的能力。然而，这些能力在未来的学习和生活过程中至关重要。

1.2 方法

采用组织贴块法[1]培养自发性高血压大鼠（8周龄）血管平滑肌细胞，鉴定血管平滑肌细胞纯度达95%以上方可用于实验。

靶向大鼠MMP-3 基因的设计与合成：针对大鼠MMP-3 基因序列构建三对小干扰核糖核酸（siRNA）序列，在GenBank中查找大鼠的MMP-3的信使核糖核酸（mRNA）全序列，通过Blast软件确定与其它非相关基因无同源性，交由百奥迈科生物技术有限公司根据序列设计合成。具体序列如下：MMP-3-siRNA-1：正义链5'-GUGGUACCCACCAAAUCUAdTdT-3、反义链5'-UAGAUUUGGUGGGUACCACdTdT-3；M M P-3-s i R N A-2：正义链5'-CCUUACUCUAGCAUGUGCUdTdT-3、反义链5'-AGCACAUGCUAGAGUAAGGdTdT-3；MMP-3-siRNA-3：正义链5'-CUUUACUUCUUCAGCGGAUdTdT-3、反义链5'-AUCCGCUGAAGAAGUAAAGdTdT-3。

siRNA转染、检测MMP-3的干扰效果： 对照组：不加任何处理；Lipofectamine 2000组：加入Lipofectamine 2000（转染试剂）；MMP-3-siRNA-1组：加入干扰载体MMP-3-siRNA-1；MMP-3-siRNA-2组：加入干扰载体MMP-3-siRNA-2；MMP-3-siRNA-3组：加入干扰载体MMP-3-siRNA-3。6孔板接种血管平滑肌细胞，2.5×105个/孔，5%CO2、37℃培养箱静置培养；第2天更换新鲜培养基，将无血清DMEM培养液200 μl、1.5 μl siRNA（20 μmol/L）和12 μl Lipofectamine 2000转染试剂混合均匀，静置15 min；将上述混合物逐滴加入到含600 μl新鲜培养液细胞中、摇匀，6 h后更换2 ml含5%胎牛血清的DMEM培养液；转染48 h后收集细胞提取总细胞RNA，测定浓度。逆转录反应按照TaKaRa（大连宝生物）逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应，体系如下：5×primeScript buffer: 2 μl， PrimeScript RT enzyme MixⅠ: 0.5 μl；Oligodt primer（50 μmol）: 0.5 μl， Random 6 mers: 0.5 μl，Total RNA: 500 ng； RNase free dH2O:加至10 μl。反应条件为: 37℃ 15 min、85℃ 5 s。实时定量聚合酶链反应（PCR）方法为MMP-3上游引

物: 5'-TTCCTTGGGCTGAAGATGAC-3'，下游引物: 5'-TCCTGGAGAATGTGAGTGGG-3'，以β-肌动蛋白（β-actin）基因为内参照。反应条件：95℃10 s、95℃5 s、60℃31 s， 40个循环，荧光信号监测。基因的定量通过样本和对照细胞的阈值循环数（Ct）值进行计算比较。定量的方法以2-ΔΔCt表示基因的表达量，实验重复3次。

蛋白免疫印迹法（Western blot）：细胞用4℃ PBS冲洗后加入裂解液及蛋白酶抑制剂，提取蛋白质， 测定浓度， 并分装。取适量蛋白质， 与2 ×SDS上样缓冲液1 ：1混合，沸水煮5～10 min， 置冰上2 min， 行15% SDS-PAGE电泳。然后转膜， 聚偏二氟乙烯膜（PVDF）用20 ml封闭液（1×TBS-0.05% Tween20 ，TBST pH 7.6）室温孵育1 h， 倒去封闭液， 加入兔抗大鼠MMP-3抗体（1:1000稀释） 4℃ 孵育过夜，TBST 洗膜3次， 每次5 min。加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗（ 1：5000稀释）室温孵育1 h， TBST洗膜3 次。膜稍滴干后加入化学发光试剂孵育1 min， 压片， 曝光时间1 min。X-胶片经显影、定影后扫描记录。以β-actin为内参照。

MMP-3-siRNA-1 对血小板源生长因子诱导血管平滑肌细胞增殖测定：将大鼠血管平滑肌细胞制备成单细胞悬液，随机分为对照组: 只加DMEM 高糖培养液；PDGF组: 加入PDGF 10 ng/ L；Lipofectamine 2000+PDGF组：加入Lipofectamine 2000+PDGF 10 ng/ L； MMP-3-siRNA-1+PDGF组:加入MMP-3-siRNA-1+PDGF 10 ng/ L。计数后调整细胞浓度， 以1 000个/孔接种于96 孔板中，加DMEM 培养液至0.1 ml，5%CO2、37℃孵箱中培养。细胞贴壁后换成0.1%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h，加入PDGF 诱导24 h 后每孔加入100 μl甲臜（Formanzan ）溶解液， 再继续孵育直至紫色结晶全部溶解， 酶标仪上选择560 nm 滤片测定吸光度值（A） 值，增殖抑制率=[1-实验组（A） 值/空白对照组（A） 值]×100%。每组6 个平行孔， 重复3 次。无细胞的孔为空白对照，取均值。

采用SPSS 10.0 软件进行统计学分析。数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶向MMP-3的siRNA对血管平滑肌细胞MMP-3基因表达的影响

靶向MMP-3的siRNA能够抑制大鼠血管平滑肌细胞MMP-3基因的表达，与对照组比较，MMP-3-siRNA-1组、 MMP-3-siRNA-2组和 MMP-3-siRNA-3组的mRNA表达水平明显降低，分别降低了81%、64%和22%。图1

图1 实时定量聚合酶链反应分析siRNA对大鼠血管平滑肌细胞MMP-3 mRNA水平的影响

2.2 靶向MMP-3的siRNA对血管平滑肌细胞MMP-3蛋白表达的影响

蛋白免疫印迹法分析结果发现，对照组和Lipofectamine 2000组比较MMP-3蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05），而MMP-3-siRNA-1组、MMP-3-siRNA-2组、MMP-3-siRNA-3组与对照组和Lipofectamine 2000组比较MMP-3蛋白水平均有不同程度降低，差异有统计学意义（P＜0.05），以MMP-3-siRNA-1组降低最为明显（P＜0.01）。图2

2.3 MMP-3-siRNA-1对PDGF诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

四甲基偶氮唑盐比色法检测吸光度值结果显示：与对照组血管平滑肌细胞的吸光度值（0. 40±0.04）比较，PDGF组（ 0.72±0. 04）、Lipofectamine 2000+PDGF组（0.71±0.06）均明显增加（P＜0. 01），差异有统计学意义。PDGF组较Lipofectamine 2000+ PDGF组差异无统计学意

义（P＞0.05）；与PDGF组相比， MMP-3-siRNA-1+ PDGF组转染能显著降低PDGF 诱导血管平滑肌细胞增殖的吸光度值（P＜0.05）。图3

图2 蛋白免疫印迹法分析siRNA对大鼠血管平滑肌细胞 MMP-3蛋白水平的影响

图3 MMP-3-siRNA-1对PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

3 讨论

MMP是一类由Zn2+依赖性的内肽酶组成的酶家族，MMP的过度表达与多种病理过程如癌症、关节炎、卒中、心血管疾病等密切相关[2，3]。研究证实细胞—基质以及细胞—细胞之间的相互作用对调节血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡起着非常重要的作用。而MMP通过调节细胞外基质的降解而在细胞—基质以及细胞—细胞之间的相互作用上起着关键的调节作用。研究发现， MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-9的表达在兔动脉血管粥样斑块中明显升高。球囊损伤后，MMP在损伤后的内皮细胞中明显增加，它们能分解细胞外基质，重塑基质构成，将血管平滑肌细胞从基底膜禁锢中解放出来，从中膜迁移到内膜，使平滑肌细胞可以移行、增殖，使内膜增厚，引起狭窄[4，5]。在腺病毒介导的基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1（TIMP-l）和基质金属蛋白酶的组织抑制剂-2（TIMP-2）基因转染实验中，颈动脉球囊损伤后的内膜形成较对照组明显减少[6，7]。MMP-1 和TIMP-1/ MMP-1 与斑块不稳定密切相关， 可作为冠状动脉斑块不稳定性预测的参考指标[8]。Johnson等[9]发现，在体实验中，敲除小鼠MMP-2基因后，颈动脉损伤模型小鼠的血管平滑肌细胞的迁移能力和内膜形成都明显减少。细胞外基质在血管平滑肌细胞生物学行为中发挥明显的作用。

作为MMP家族主要成员，MMP-3不仅能够强力降解细胞外基质，同时又可以激活MMP-l、MMP-8、MMP-9的活性，共同参与细胞外基质的降解过程。在体内许多内源性生长因子、细胞因子可调节MMP-3活性，白细胞介素-1（IL-1）和PDGF是最常见的共同存在于动脉粥样硬化病变处的生物因子。Hoshino等[10]在研究与Ⅱ型肺泡细胞同源的A549细胞时发现，IL-1β可增加MMP-3的表达。研究发现，MMP-3在粥样硬化病变的基质蛋白降解中起重要作用，冠状动脉斑块破裂常与细胞外基质在某些部位的缺失有关，在斑块破裂区域，基质金属蛋白酶家族MMP表达增强，这通过降解细胞外基质导致斑块纤维帽的削弱。通过原位mRNA杂交发现，冠状动脉粥样硬化斑块中存在MMP-3，且高度局限于斑块易破裂的纤维帽肩部而导致斑块破裂[11]。 MMP-3在不稳定性心绞痛及急性心肌梗死患者中增高，可能是粥样硬化斑块存在的冠心病初筛指标及不稳定斑块的潜在指标[12]。

Zhang等[13]研究则发现，过表达MMP-3特异抑制物TIMP-3可抑制前列腺肿瘤细胞的增殖及入侵，提示MMP-3在细胞增殖方面发挥重要作用。

我们构建了靶向MMP-3的siRNA，并成功的筛选出能够有效沉默MMP-3基因的干扰序列。我们用10 ng/ml的PDGF刺激大鼠的血管平滑肌细胞，发现PDGF能够诱导血管平滑肌细胞的增殖，靶向MMP-3基因的siRNA能够显著抑制MMP-3基因的表达，同时siRNA能够显著抑制PDGF诱导的细胞增殖，与之前Southgate等[14]研究相似。由于自发性高血压大鼠自身特点及高血压性心血管病变，其与正常大鼠血管平滑肌细胞生物学行为可能存在不同，具体差异有待进一步研究。

本研究结果提示MMP-3参与了PDGF诱导的细胞增殖，MMP-3可作为血管增殖性疾病治疗的新靶点，这为我们进一步研究血管增殖性疾病治疗提供理论依据。但血管增殖性疾病发生、发展过程极其复杂、可能涉及巨噬细胞、细胞外基质的合成与降解、细胞生长、分裂、迁移等，其作用的复杂机制尚需进一步深入研究。

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Effect of RNA Small Interfering Sequence of MMP-3 on Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation in Experimental Rats

HUANG Jie, FENG Yan, HAN Ling, LI Yan, ZHANG Jing-jing, SONG Kun-peng, SHI Hai-li.
Department of Cardiology, The Affliated Central Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450007), Henan, China

Objective: To study the effect of RNA small interfering (siRNA) sequence of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) on vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation in experimental rats.

Matrix metalloproteinase-3; Vascular smooth muscle cells; RNA interference; Proliferation

2014-07-16）

（编辑：漆利萍）

郑州市科技攻关计划项目（No：112PPTSF312-3）

450007 河南省郑州市，郑州大学附属郑州中心医院 心血管内科

黄捷 副主任医师 博士 主要从事冠心病的诊治临床研究 Email: huangjie-md@163.com 通讯作者：黄捷

R541

A

1000-3614（2015）02-0159-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.016