应用丝素膜真皮支架对创面愈合过程中成纤维细胞功能的影响

张 剑　窦 懿　廖镇江

（上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科，上海 200025）

应用丝素膜真皮支架对创面愈合过程中成纤维细胞功能的影响

张 剑窦 懿廖镇江

（上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科，上海 200025）

目的：动态观察创面应用丝素膜真皮支架对创面修复过程中成纤维细胞(Fb)功能的影响。方法： 50只雄性SD大鼠，随机分为聚乙烯醇海绵组（海绵组）和丝素膜组（n=25）。于大鼠背部正中切取皮肤制成2 cm×2 cm全层皮肤缺损创面，分别在创面埋植聚乙烯醇海绵（海绵组）或丝素膜（丝素膜组），再覆以自体刃厚皮缝合。术后1、2、3、4、6周取移植物及其周围组织，HE染色观察其组织形态学变化，免疫组化法检测组织α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，TUNEL法检测细胞凋亡水平。结果：光镜观察发现，术后1～2周，丝素膜组肉芽组织化较海绵组快，胶原纤维较密集；术后6周，与海绵组相比, 丝素膜组胶原纤维较粗大,组织相对成熟。术后组织中α-SMA及TGF-β1表达增加，α-SMA表达量于术后2周达到高峰，之后逐渐下降。丝素膜组α-SMA表达量低于海绵组，在第1、6周与海绵组比较差异有显著性(P＜0.01)；海绵组TGF-β1表达量于术后2周达到高峰，丝素膜组于术后第3周达高峰，除第3周外，丝素膜组TGF-β1表达量均低于海绵组，在第1、2、6周与海绵组比较差异有显著性(P＜0.01)。丝素膜组细胞凋亡率在术后各时相点均显著高于海绵组 (P＜0.01)。结论：丝素膜与自体刃厚皮复合移植后，可不同程度减少Fb中α-SMA及TGF-β1的表达，并促进细胞凋亡，加快组织重塑，有利于组织修复的完成，对防止瘢痕过度形成具有积极意义。

丝素膜α-平滑肌肌动蛋白转化生长因子-β1细胞凋亡创面愈合

利用组织工程原理构建人工皮肤替代物用于皮肤移植，可有效解决严重烧伤和大面积烧伤供皮不足的难题。虽然目前已有许多较为成熟的皮肤修复材料，但它们都存在诸多缺陷，其中成本过高和再生修复性能不足是关键[1]。家蚕蚕丝中的丝素蛋白成分是一种天然的高分子聚合物，作为手术缝线用于临床已有100多年的历史。近年来，由于其低免疫原性、良好的生物相容性及特有的理化性质，丝素蛋白作为一种新的生物材料在医学领域中的应用越来越受到关注[2]。成纤维细胞（Fb）是创面愈合的主要修复细胞之一，参与多种细胞外基质的分泌。本研究中，我们将丝素蛋白制成多孔结构的支架材料—丝素膜，应用于大鼠真皮缺损创面，观察丝素膜植入后对Fb生物学行为的影响，了解其在创面愈合过程中的作用。聚乙烯醇具有与人体组织相近的含水量、良好的生物相容性和较高的机械强度，在生物医学方面获得了广泛的应用。本研究中我们采用商品化聚乙烯醇海绵作为对照组，观察丝素膜的应用效果。

1　材料和方法

1.1实验动物与模型制备将聚乙烯醇海绵（北京康安生物技术有限公司）和丝素膜材料（苏州大学材料工程学院）剪成20 mm×20 mm大小（厚2 mm），浸于生理盐水中备用。 SPF级雄性SD大鼠（购自中国医学科学院上海实验动物中心）50只，体重230～250 g，随机分为丝素膜组和海绵组，每组25只。于术前1 d硫化钡脱毛， 2.5%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，背部消毒，用手术刀于背部正中切取2 cm×2 cm全层皮肤，并反取成刃厚皮备用。丝素膜组和海绵组创面分别埋植丝素膜材料和聚乙烯醇海绵，外加自体刃厚皮缝合（厚度为0.20 mm），包扎，换药。于术后1、2、3、4和6周取材，每个时相点取材动物数5只，切取移植物及其周围组织，立刻以4%甲醛固定备用。

1.2观察指标与方法

1.2.1组织学观察标本固定后常规脱水，透明，浸蜡包埋，制备4 µm连续切片，黏附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，明矾苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察组织形态学结构。

1.2.2免疫组化法检测创面组织中平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及转化生长因子β1（TGF-β1）表达采用SP法(试剂盒购自福建迈新生物技术开发公司)，主要步骤如下：石蜡切片，常规脱蜡至水；室温下内源性过氧化酶封闭液作用10 min，0.1 mol/L、pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗10 min；羊血清蛋白封闭15 min；加入小鼠源性一抗（抗α-SMA及TGF-β1单抗，分别购自Abcam公司及DAKO公司，工作液浓度分别为1∶300和1∶100），4 ℃孵育过夜；PBS漂洗3 min×3次；羊抗小鼠二抗室温孵育30 min；PBS漂洗3 min×3次；加SP试剂，室温作用30 min；PBS漂洗3 min×3次；5 mg重氮氨基苯（DAB）+ PBS 10 ml+0.3%双氧水100 µl，显色3～5 min；流水冲洗、苏木素衬染、脱水，中性树脂封片。以棕褐色深染为阳性表达。

1.2.3TUNEL法检测细胞凋亡凋亡试剂盒购自DAKO公司，主要步骤如下：石蜡切片，常规脱蜡至水；内源性过氧化酶封闭液室温封闭10 min；室温下蛋白酶K抗原修复10 min， PBS漂洗3 min×3次；加入平衡缓冲液孵育5 min；加TDT酶，37 ℃孵育1 h；室温下加终止缓冲液孵育10 min；PBS漂洗3 min×3次；链霉亲和素-辣根过氧化物酶室温孵育30 min；PBS漂洗3 min×3次；DAB显色3～5 min；流水冲洗、苏木素衬染、脱水，中性树脂封片。以棕褐色深染为阳性表达。

1.3资料分析方法采用KS400图像分析系统（德国Kaiser公司）。免疫组化结果：200倍镜下每张切片随机选取2个视野，测量窗面积为94 879.82 µm2，测量阳性细胞面积百分比（阳性细胞表达面积/测量窗面积）。细胞凋亡检测：200倍镜下每张切片随机选取2个视野，采图后人工计数，测量凋亡细胞百分比（阳性细胞数/细胞总数）。

2　结 果

2.1组织学观察术后1周，两组创面光镜下观察均可见Fb和炎症细胞迁入支架，近基底部细胞较多。术后 2周植入支架材料内细胞数量大量增加,布满整个材料,肉芽组织形成增加,丝素膜组胶原纤维较海绵组密集；随着材料肉芽组织化，植入材料有所降解(图1，见封二)。术后3～6周，与海绵组比较,丝素膜组Fb数量减少，胶原纤维较粗大,形成组织相对成熟，材料与周围组织融合较好。

2.2TGF-β1表达免疫组化检测结果显示，术后丝素膜组及海绵组TGF-β1表达均上升，海绵组于术后2周达到高峰，丝素膜组于术后第3周达高峰，之后逐渐下降。除第3周外，丝素膜组TGF-β1表达量均低于海绵组，术后第1、2、3、6周与海绵组比较，差异均具有显著性[P＜0.01，图2、图3（见封二）]。结果表明：丝素膜支架植入体内后能够减少TGF-β1的表达。

图2　不同支架材料处理后创面组织中TGF-β1的表达

2.3α-SMA的表达免疫组化检测发现，创面愈合早期，两组创面组织中α-SMA表达量均上升，呈强阳性，术后2周达到高峰，之后逐渐下降。丝素膜组α-SMA表达量低于海绵组，在第1周、6周与海绵组比较差异有显著性 (P＜0.01)。术后第6周，海绵组组织中α-SMA表达量虽明显减少，但仍呈强阳性表达。而丝素膜组第6周α-SMA呈弱阳性表达 [表1、图4(见封二）]。结果表明，创面愈合后期丝素膜支架能够减少α-SMA的表达。

2.4细胞凋亡的检测术后1～6周，丝素膜组及海绵组细胞凋亡率逐渐上升，丝素膜组细胞凋亡率在术后各时相点均高于海绵组[图5、图6（见封二）]，两者相比差异有显著性（P＜0.01）。表明丝素膜支架植入创面后能够促进细胞凋亡。

图5　创面不同支架材料组织中细胞凋亡率的比较

表1　术后不同时间点创面组织中α-SMA阳性细胞表达面积百分比（x± s，%， n=5）

3　讨　论

丝素膜是由丝素蛋白经物理或化学方法合成的三维生物支架材料。丝素蛋白是蚕丝的主要成分，其无毒性，无抗原刺激性，具有良好的生物相容性及可降解性[2]，并具备来源广泛、纯度高、价格低廉等优势，丝素蛋白的分子结构和形态还可以通过表面修饰技术等多种方法加以改进，这些特性使得丝素蛋白在生物材料和组织工程领域的应用变得日益广泛。研究发现，丝素蛋白对机体细胞黏附能力强，能促进细胞生长，如丝素蛋白材料可在体外用作培养角质形成细胞、成纤维细胞、成骨细胞等的载体，细胞生长良好[3]。理想的皮肤替代物除能快速血管化外，还需能够调控Fb等修复细胞功能以使其既能满足组织充填替代的作用、又不会导致过度增生而影响修复效果。研究证实，应用丝素膜后能够促进细胞迁移和血管化[4]。本研究中观察了丝素膜对创面愈合过程中Fb生物学行为的影响，进一步评价其作为生物真皮支架应用于创面修复的可能性。

需要说明的是，虽然组织中尚存在其他细胞，但考虑到 Fb是真皮层参与创面修复的主要细胞，占据数量上的绝对优势，故本研究通过检测组织中α-SMA、TGF-β1表达水平及细胞凋亡水平来反映Fb的表达水平。本研究所采用的“复合移植”方法（皮肤替代物+自体刃厚皮移植）不同于非植皮的自然愈合创面，故未采用创面愈合时间作为评价指标，只能通过生化指标来间接反映组织修复。

研究认为，病理性瘢痕中细胞外基质尤其是胶原的过度沉积，与Fb功能异常活跃、分泌大量胶原等细胞外基质密切相关[5]。肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)是Fb的分化亚型，因其细胞中表达α-SMA而得名。正常皮肤组织中α-SMA仅见于血管平滑肌细胞，创伤愈合过程中，参与创伤修复的Fb中亦可见α-SMA的表达[6]，因此这种类似平滑肌细胞的Fb又称MFB。研究发现，该细胞亚型不仅具有Fb的旺盛合成功能，还因其表达有α-SMA而具有比Fb更强的收缩功能[7]。正常愈合情况下，如正常愈合的切口伤中，MFB可短暂出现，在创面愈合后即通过凋亡途径被清除，而在瘢痕过度增生或纤维化疾病中则持续大量存在[8]。Desmoulière等[9]研究认为，虽然MFB在创面愈合和组织重塑中发挥了重要作用，但愈合后期，功能活跃的MFB或Fb的凋亡延迟或不足，则可能成为导致瘢痕过度增生的一个重要原因。本研究检测了组织中α-SMA和细胞凋亡水平。结果显示，术后2～4周丝素膜组与海绵组相比α-SMA的表达无显著差异，术后6周则显著低于海绵组，表明创面修复高峰期丝素膜并未明显影响Fb向MFB转化的比例，但在创面愈合后期可促进MFB比例的下调。术后各时相点丝素膜组细胞凋亡水平均显著高于对照组，表明丝素膜可促进细胞凋亡。推测，丝素膜不但可以调控创面愈合后期组织中MFB的比例，还可通过促进细胞凋亡适时清除Fb，防止功能活跃的Fb持续大量存在，有助于改善创面愈合质量。

TGF-β1作为重要的致纤维化因子，是目前已知与瘢痕形成关系最密切、最具代表性的功能多样的生长因子。TGF-β1的一个重要功能是促进α-SMA在Fb中的表达，诱导Fb向MFB的转化[10]；TGF-β1还可通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达及稳定Bcl-2家族蛋白的水平而拮抗多种促细胞凋亡因子的作用，抑制MFB的凋亡[11]。基质金属蛋白酶（MMPs）是参与细胞外基质降解的主要蛋白酶之一，MMPs及其组织抑制因子（TIMPs）的相对水平在基质的沉积与重塑中发挥重要作用[12]。TGF-β1可抑制Fb中MMP的活性[13]，从而促进细胞外基质的沉积，影响组织重塑进程。因此，TGF-β1的高表达有利于Fb转化为MFB，持续地发挥其收缩及合成功能，促进细胞外基质的沉积，在组织修复中起重要作用，但如果过度表达，可能会导致瘢痕的过度增生。本研究中丝素膜应用后可在一定程度上减少TGF-β1的表达，有利于调控MFB的形成及细胞凋亡水平、促进细胞外基质重塑，影响创面愈合过程。而组织学观察显示，丝素膜组胶原纤维较粗大, 形成组织相对成熟，材料与周围组织融合较好，可能与丝素膜调控Fb功能、加速组织重塑有关。

虽然丝素膜组α-SMA、TGF-β1量较低，但其早期组织填充效果要优于海绵组，愈合后期组织较海绵组成熟，能够获得这种结果可能跟丝素膜组有较为合适的孔径有关。海绵组孔径较大，不利于组织填充及组织重塑的完成。

综上所述，丝素膜应用后对创面愈合过程中Fb生物学行为的影响有助于改善深度缺损创面的愈合质量，可作为生物支架材料用于皮肤组织缺损的修复。当然，如何通过改进工艺使丝素膜达到最佳的治疗效果，最大程度地减少瘢痕形成，仍有待深入、系统的研究。

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Effect of silk fibroin membrane as dermal scaffold on the fibroblast behaviors in wound healing

Zhang Jian , Dou Yi, Liao Zhenjiang.
Department of Burn Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, ShangHai 200025, China

Objective: To dynamically investigate the effect of silk fibroin membrane as dermal scaffold on the fibroblast behaviors in wound healing. Methods: Fifty male SD rats with a full-thickness wound the size of 2 cm×2 cm on the back skin were randomly divided into 2 groups. The silk fibroin membrane group was covered by silk fibroin membrane with overlying thin split-thickness autograft, while that of the sponge group was covered by a PVA sponge and split-thickness autograft as control. Wound specimens were obtained at 1st, 2nd, 3rd, 4th, and 6th week post operation. Histological changes of wound tissues were observed with HE staining, and α-smooth muscle actin (α-SMA) and expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were detected by immunohistochemical staining, and cell apoptosis was revealed by TUNEL assay. Results: HE staining showed faster formation of granulation tissue and denser collagen fiber in silk fibroin membrane group than in sponge group 1-2 weeks after surgery. Six weeks after operation, the collagen fiber in the silk fibroin membrane group was thicker and the newly-formed tissue was relatively mature as compared with that of the sponge group. The expression of α-SMA and TGF-β1 was increased gradually during wound healing in both groups, and α-SMA expression reached a peak in 2nd week, and then it decreased. The silk fibroin membrane group showed a lower expression of α-SMA than that of the sponge group, and the difference was markedly significant at 1st and 6th week (P＜0.01). The expression of TGF-β1 reached a peak at 2nd week in sponge group, whereas the peak appeared in 3rd week in silk fibroin membrane group, and it was significantly lower when compared with that of sponge groups at 1st, 2nd and 6th week(P＜0.01). The percentage of cell apoptosis was significantly higher in silk fibroin membrane group during the designed experimental time when compared with sponge group (P＜0.01). Conclusions: The silk fibroin membrane when used together with split-thickness autograft could reduce the expression of α-SMA and TGF-β1 in different degrees, promote cell apoptosis, and speed up tissue remodeling, suggesting that it might improve tissue formation and prevent excessive scar formation.

Silk fibroin membraneα-smooth muscle actinTransforming growth factor-β1Apoptosis Wound healing

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04 . 001

国家重点基础研究发展规划项目资助（G1999054205）

2015-07-29)