基于纳米金表面等离子体的高灵敏过氧化氢光学检测方法

李娜娜，黄嘉荣，詹求强

(华南师范大学华南先进光电子研究院，广州510006)

纳米金表面等离子体因其独特的光学、化学性质和良好的生物相容性，近年来被广泛用于光学探针、电化学传感和生物传感等领域［1－2］. 纳米金具有明显的表面等离子体共振吸收峰，其波长与纳米金的粒径、周围的介质、粒子的间距等密切相关，导致纳米金溶胶颜色差异较大［3］. 纳米金比色法则通过纳米金溶液颜色的变化检测微量样品. 在纳米金比色法中，微量的待测样品可改变纳米金颗粒的聚集情况，从而导致溶液产生颜色变化，用肉眼即可分辨.

结合抗体或其他靶向试剂(如蛋白质、多肽和核酸)，纳米金比色法被广泛用于金属离子［4－5］、DNA［6－7］、生物酶［8－9］等目标分子的微量检测和分析. 与传统荧光分子相比，纳米金具有很高的消光系数，其检测灵敏度可达到荧光分子的103～104倍［10－11］. 纳米金比色法以其简单快速、灵敏度高、肉眼可分辨且不需要借助复杂仪器等卓越优势，在生化检测、环境检测等领域具有广阔的应用前景［12－13］.

过氧化氢(H2O2)在生化领域应用广泛，尤其常用于传统的酶联免疫吸附检测技术中. 利用纳米金比色法设计检测微量H2O2的方法，可得到较高的检测灵敏度［14］. 结合酶联免疫吸附技术，该方法可直观快速、灵敏地检测多种微量目标物质. 将传统酶联免疫吸附技术和纳米金测定H2O2的方法相结合，已经成为一种新型的检测艾滋病病毒技术［15］，检测灵敏度可达到10－18g/mL，比目前检测技术高10 倍以上.该技术用过氧化氢酶标记HIV-1 衣壳抗原p24，浓度极低的p24 即可引起H2O2浓度的减小和纳米金颗粒的不规则聚集，进而使溶液颜色呈现蓝色;阴性结果则是纳米金粒子仍保持为单分散形态，溶液颜色显示为红色，用肉眼就可以分辨出以上的颜色变化. 运用这个技术，在釆用常规核酸检测方法都无法检出的情况下，研究人员可以在HIV 患者血液中检测出超低浓度的p24. 但该技术具有一定的局限性:(1)反应体系稳定性较差，其结果随反应时间的变化较快，为检验带来不便;(2)只能定性分析所测样品浓度在检测极限范围内外，却无法精确定量. 本文在此基础上，应用纳米金表面等离子体建立微量H2O2的检测体系，提高反应体系的稳定性并探索精确定量方法，并降低检测的分辨极限，为微量样品检测提供更好的平台.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外－可见－近红外分光光度计(PerkinElmer，Lambda 950);酶标仪(Bio-Rad，iMark);电子透射显微镜;磁力搅拌器;pH 计;2-吗啉乙磺酸(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司);氢氧化钠(国药试剂，分析纯);过氧化氢(阿拉丁试剂有限公司，分析纯);氯金酸(阿拉丁试剂有限公司，Au≥48%).

1.2 实验方法

取1.95 g 2-吗啉乙磺酸粉末溶于80 mL 去离子水中，在磁力搅拌下用1 mol/L 过氧化氢溶液调节pH 6.5，转移至100 mL 容量瓶定容，为100 mmol/L 2-吗啉乙磺酸储备液，室温储存备用. 另外，将1 g氯金酸粉末溶于25.4 mL 去离子水中，为100 mmol/L 氯金酸储备液，避光存于4 ℃中，保存时间勿超过15 d. 称取0.012 3 g 还原型半胱甘肽粉末溶于100 mL 去离子水中，配制成400 μmol/L 半胱甘肽溶液，4 ℃保存.

使用1 mmol/L 的2-吗啉乙磺酸溶液配置浓度为20 ～200 μmol/L 的H2O2溶液以及0.2 mmol/L 氯金酸溶液，现配现用.于96 孔板中，每孔各加100 μL氯金酸溶液和100 μL H2O2溶液，静置反应10 min.向各反应孔加入10 μL 半胱甘肽溶液，并于紫外－可见－近红外分光光度计或者酶标仪下读取吸光度.反应系统稳定情况检测部分未加半胱甘肽溶液.

2 结果与讨论

2.1 裸眼检测体系的辨色极限及金颗粒电镜图

2-吗啉乙磺酸可作为一种弱还原剂，与氯金酸溶液反应将生成团聚态的纳米金颗粒，反应溶液呈现裸眼可辨的蓝色. 此时，如果加入过量的H2O2作为辅助还原剂，将促进反应生成分散态的纳米金颗粒，使反应溶液呈现红色. 因此，纳米金表面等离子体可作为检测微量H2O2的灵敏探针.

实验分别检测0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 及200 μmol/L 的H2O2溶液，反应10 min后辨色(图1). 当H2O2的浓度c ＜100 μmol/L 时，反应溶液肉眼观察显示蓝色;当c ＞120 μmol/L 时，反应溶液呈现红色. 该检测体系裸眼检测H2O2极限可分辨浓度差为20 μmol/L.

其中，取加入了60 μmol/L 和160 μmol/L H2O2的反应孔产物分别作为蓝色和红色反应孔的代表，制备铜网样品，用电子透射电镜观察结果(图2).蓝色反应孔的反应产物为团聚态的的纳米金颗粒，红色反应孔的反应产物为分散态的纳米金颗粒，与实验原理相符.

图1 不同H2O2 浓度反应孔的辨色图Figure 1 Photograph of nanoparticle solutions for different H2O2 concentrations

图2 不同颜色反应孔产物电镜图Figure 2 TEM images of nanoparticles in solutions of different colors

2.2 反应体系稳定性分析及其终止

2.2.1 反应体系的稳定性分析 实验发现，反应体系在3 h 内稳定性差，且在反应进行45 min 内颜色变化较快，对下一步检测和定量分析带来困难. 随着反应时间增加，c ＞120 μmol/L 的反应孔所生成的分散态纳米金颗粒将逐渐增加，红色逐渐加深;c＜100 μmol/L 的反应孔也将生成分散态的纳米金颗粒，逐渐呈现红色，具体辨色结果见图3A. 反应进行15 min 后，c 为100 μmol/L 和80 μmol/L 的反应孔开始略微变红;反应进行20 min 后，此2 孔与更低过氧化氢浓度的反应孔颜色有明显区别，呈现红色，并逐渐加深(图3A). 此外，c ＜60 μmol/L 的反应孔所呈现的蓝颜色也随着反应时间不断加深.其中，c=60 μmol/L 的反应孔在反应进行45 min 后也已变为红色.

由于纳米金溶液在波长为570 nm 处有特征吸收，实验也通过检测溶液在570 nm 处的吸光度(OD570)来监测纳米金生成的稳定情况. 图3B 为不同反应时间各反应孔的吸光度OD570变化曲线. c＞180 μmol/L 的反应孔在反应10 min 后OD570保持不变，反应稳定;而c ＜160 μmol/L 时，反应孔的OD570则在反应45 min 内变化较快，之后达到稳定.此外，随着反应孔中所加入H2O2浓度的降低，反应体系的OD570需要的稳定时间明显增加，与辨色结果中较低H2O2浓度反应孔逐渐变红的现象相吻合.

图3 不同反应时间下不同浓度H2O2 的稳定情况Figure 3 Detection stability of different reaction time for different hydrogen peroxide concentrations

2.2.2 半胱甘肽对反应体系的终止效果 为了方便下一步的检测和量化分析，实验使用还原型半胱甘肽作为反应体系的终止剂，以提高反应体系的稳定性. 由于还原型半胱甘肽对纳米金颗粒表面具有较好的亲和性，反应体系中的半胱甘肽将附着于纳米金表面，从而阻止了金颗粒的进一步团聚，终止反应. 反应进行10 min 后，向各反应孔中加入10 μL的半胱甘肽溶液，所得不同反应时间各反应孔情况见图4A. 加入半胱甘肽后，各反应孔的辨色结果不再随时间改变，c ＜100 μmol/L 的反应孔保持蓝色，c ＞120 μmol/L 的反应孔保持红色. 不同反应时间各反应孔的吸光度OD570变化曲线见图4B. 加入半胱甘肽后，各反应孔在反应15 min 后的OD570基本不变，反应稳定，与辨色结果中各反应孔颜色稳定的现象相吻合. 实验表明，还原型半胱甘肽溶液可有效终止各孔的反应，使纳米金颗粒的状态稳定.

图4 加入半胱甘肽后不同反应时间下H2O2 的稳定情况Figure 4 Detection stability of different reaction time with L-glutathione for different hydrogen peroxide concentrations

2.3 检测结果吸收光谱及定量分析

为了精确定量H2O2浓度，实验使用紫外－可见－近红外分光光度计测定不同H2O2浓度反应孔生成物的吸收光谱(图5A). c ＜100 μmol/L 的反应孔产物在波长约550 nm 处有吸收峰，且吸收强度与c 成正相关. 而c ＞120 μmol/L 的反应孔产物吸收峰逐渐往短波长方向偏移，最终峰值约为540 nm.实验对各反应孔产物在630 nm 和545 nm 处吸光度的比值(OD630/545)进行分析，得到不同浓度H2O2的定量分析曲线(图5B). 各反应孔产物的OD630/545与c(μmol/L)呈良好的线性关系，其回归方程为OD630/545=－0.003 02c+1.011 77.

图5 不同浓度过氧化氢反应孔的吸收光谱及定量分析Figure 5 Ultraviolet-visible spectra and linear relativity of regressive curves of OD630/545 for different H2O2 concentrations

2.4 裸眼分辨极限下的检测分析

根据定量分析曲线，可有效地对裸眼分辨极限下的检测样品进行定量分析. 实验设计了加入100、102、104、106、108、110、112、114、116、118 和120 μmol/L 过氧化氢的反应孔，辨色结果见图6. c =100 μmol/L 的反应孔呈现蓝色，c =120 μmol/L 的反应孔呈现红色，而中间浓度的反应孔呈现从蓝色过渡到红色的辨色结果，裸眼难以区分. 实验中各反应孔的吸光度OD630/545如图7 所示，OD630/545与过氧化氢浓度c(μmol/L)呈良好的线性关系. 应用OD630/545可精确定量H2O2浓度，降低裸眼检测途径下该方法的分辨极限.

图6 不同浓度过氧化氢反应孔的辨色图(100 ～120 μmol/L)Figure 6 Photograph of nanoparticle solutions for different H2O2 concentrations (100 ～120 μmol/L)

图7 裸眼分辨极限下不同浓度过氧化氢反应孔吸光度OD630/545(100 ～120 μmol/L)Figure 7 OD630/545 for different H2O2 concentrations (100 ～120 μmol/L)beyond the limit of detecting resolution with naked eyes

3 结论

本实验在酸性2-吗啉乙磺酸介质中，建立基于纳米金表面等离子体的微量过氧化氢的检测体系，其裸眼检测H2O2极限可分辨浓度差为20 μmol/L.实验使用半胱甘肽有效终止反应，提高了体系的稳定性，并利用光谱分析精确定量H2O2浓度，降低裸眼检测途径下该方法的分辨极限. 该检测方法操作简单、灵敏度高，便于结合传统酶联免疫吸附技术，在微量生物分子检测领域有广阔应用前景.

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