液相色谱－串联质谱法同时测定烟草中6种Amadori化合物

贾春晓，修龙飞，牟定荣，毛多斌

（1．郑州轻工业学院材料与化学工程学院，河南郑州 450002；2．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002；3．红塔烟草（集团）有限公司技术中心，云南玉溪 653100）

液相色谱－串联质谱法同时测定烟草中6种Amadori化合物

贾春晓1，修龙飞2，牟定荣3，毛多斌2

（1．郑州轻工业学院材料与化学工程学院，河南郑州 450002；2．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002；3．红塔烟草（集团）有限公司技术中心，云南玉溪 653100）

建立了液相色谱－串联质谱法同时测定烟草中6种Amadori化合物的定性和定量分析方法。试样以70％甲醇水溶液为萃取剂，经过正交实验优化后的超声萃取条件为：料液比1∶30、萃取功率120W，萃取时间25min。所得萃取液用正己烷洗涤除去杂质后，在选择反应监测模式下进行液相色谱－串联质谱定性及定量分析，其中Amadori化合物采用外标标准曲线法定量。结果表明：所测定的6种Amadori化合物线性关系良好，相关系数r均大于0．995 0。方法的检出限（LOD）为20．06～39．86μg／kg，定量限（LOQ）为66．85～132．9μg／kg，平均回收率在86．56％～88．86％之间，相对标准偏差（RSD）均小于5％。该方法简便、灵敏度高、重现性好，适用于烟草中Amadori化合物的定性和定量分析。

烟草；液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）；Amadori化合物

Amadori化合物是由还原糖和氨基酸经缩合、脱水、Amadori重排而得到的一类Mainland反应中间产物，即1－氨基－1－脱氧－2－酮糖［1］，它是烟草中一种重要的香味前体物质［2］。Amadori化合物在通常状态下没有气味，但在卷烟燃吸过程中，能够裂解释放出对卷烟香气具有重要贡献的香味物质，如吡嗪类、呋喃类以及吡咯类化合物等［3－4］。因此，研究其萃取条件和分析其在烟草中的含量，对评价烟草的内在质量及提高卷烟香气具有重要的指导意义。

Amadori化合物极性强、种类多、结构类似，对其进行定性定量分析难度较大［5］。目前，国内外对于Amadori化合物的分析主要采用气相色谱（GC）法［6］、高效液相色谱（HPLC）法［7－9］、高效液相色谱－质谱（HPLC／MS）法［10］、离子交换色谱（IEC）法和离子交换色谱－串联质谱（IEC－MS／MS）法［11－13］等，其中，HPLC／MS和IEC－MS／MS法是目前最有效的定性分析方法。然而，由于没有市售标准品，采用标准样品同时进行Amadori化合物的定量分析研究鲜有报道。

液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）具有快速、简便、灵敏度高等优点［14－15］。本研究拟采用超声波辅助萃取，并通过正交实验优化前处理条件，在此基础上采用LC－MS／MS技术，并结合标准样品，对烟草中的Amadori化合物进行定性鉴定；另外，采用标准曲线法对烟草中的6种Amadori化合物进行定量测定。

1 实验部分

1．1 仪器

LTQ XL型液相色谱－串联质谱仪：美国Thermo公司产品，配有电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur 2．2数据处理系统；KQ－5200DB型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司产品；SHZ－D（Ⅲ）型循环水真空泵：郑州市中原科技仪器厂产品；AB265－S型分析天平（感量0．000 01g）：瑞士Mettler公司产品；RE－52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂产品；Mili－Q超纯水仪：美国Milipore公司产品。

1．2 主要材料与试剂

甘氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru－Gly）、丙氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru－Ala）、脯氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru－Pro）、苏氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru－Thr）、谷氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru－Glu）、α－氨基丁酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru－Amb）标准对照品：本课题组用化学合成法自制，其结构经红外光谱、核磁共振、多级质谱及高分辨质谱表征，纯度均大于98％；实验用水：Mili－Q超纯水；甲醇（色谱纯）、无水甲醇（分析纯）：天津四友精细化工有限公司产品；正己烷（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司产品；甲酸：美国Acros Organics公司产品。

1．3 烟叶样品的前处理

各种烟叶样品均由红塔烟草集团提供。将烟叶样品于30℃烘干粉碎，过60目筛。准确称取2．000g烟叶粉末，置于带塞锥形瓶中，加入70％甲醇水溶液，在料液比1∶30，功率120W的条件下，超声萃取20min；抽滤后，滤渣用70％甲醇水溶液洗涤3次（每次30mL），合并滤液和洗涤液，在减压条件下于30℃旋转蒸发

浓缩至干；然后，用50mL 70％甲醇水溶液溶解，正己烷洗涤3次（每次30mL），以除去色素等杂质；将洗涤后的甲醇－水相浓缩至干，再用70％甲醇水溶液定容至10mL，过0．45μm有机滤膜，待LC－MS／MS分析。

1．4 实验条件

1．4．1 色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil Gold（100mm×2．1mm×1．9μm）；流动相：甲醇－水（0．1％甲酸）溶液（50∶50，V／V）；等度洗脱；流速200μL／min；柱温20℃；自动进样，进样量2μL。

1．4．2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，选择反应监测模式（SRM），离子源喷雾电压5kV，毛细管电压12V，透镜电压50V，毛细管温度350℃，气体（N2）压力250kPa，质量扫描范围m／z 200～500。6种目标化合物的定性和定量离子对及碰撞能量等参数列于表1。

表1 Amadori化合物质谱检测条件Table 1 MS／MS conditions for the detection of Amadori compounds

2 结果与讨论

2．1 超声萃取条件的优化

2．1．1 单因素实验 考察萃取条件时，以烟叶样品中Amadori化合物的实际萃取量为指标。因为萃取量与其峰面积成正比，所以用6种Amadori化合物的总峰面积的对数值代表其总萃取量，以烟叶中Amadori化合物的总萃取量为指标，分别考察了萃取溶剂、所选溶剂浓度、料液比（烟叶样品质量与萃取溶剂体积之比，g／mL）、超声功率和萃取时间对萃取量的影响。

由于Amadori化合物具有较大的极性，因此分别选用甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙腈为萃取溶剂，固定其他条件对烟叶样品进行萃取。结果表明，甲醇的萃取效果最好。根据上述结果，又考察了不同浓度的甲醇水溶液（50％、60％、 70％、80％、90％）对萃取量的影响。结果表明，用70％甲醇水溶液作为萃取溶剂时，Amadori化合物的总萃取量最大。

以70％甲醇水溶液作为萃取溶剂，分别考察了不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），不同超声功率（80、100、120、140、160W）以及不同萃取时间（10、15、20、25、30min）的萃取结果，示于图1。由图1可知，当料液比为1∶30，超声功率为120W，超声时间为20min时，总萃取量达到最大值。

2．1．2 正交实验设计及结果分析 根据单因素实验结果，以料液比（A）、萃取功率（B）、萃取时间（C）为影响因素进行正交实验，选用L9（34）正交实验表安排实验因素水平。正交实验因素水平表及正交结果分别列于表2和表3。

图1 料液比，超声功率和萃取时间对萃取结果的影响Fig．1 The effect of solid－liquid ratio，ultrasonic power and extraction time vs extraction results

表2 正交实验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

由表3可知，极差R是各因素对Amaodri化合物萃取因素的影响程度，因素主次顺序为A＞B＞C，即萃取料液比是影响提取效果的主要因素，其次为萃取功率，而萃取时间的影响最小。比较K1、K2、K3可知，Amadori化合物的最佳萃取条件为A2B2C3，即料液比1∶30、萃取功率120W、萃取时间25min。

2．2 质谱条件的优化

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal experiments

Amadori化合物含有羧基和多个羟基，容易加和氢离子形成正电荷母离子［M＋1］＋，因此，选用正离子模式对Amadori化合物的混合标准溶液进行全扫描，以确定分子离子峰。然后优化碰撞能量，使母离子进一步碎裂，并对其子离子进行全扫描。在此基础上，选择2个信噪比高、峰形好、干扰小的特征子离子作为定性离子对，并将响应值最高的2个子离子作为定量离子对，采用SRM扫描模式，该方法鉴别点

（IPs）均能满足欧盟2002／657／EC的决议要求［16］。所得6种Amadori化合物的SRM色谱图示于图2。

2．3 线性方程、相关系数和检出限

准确称取0．010 20g Fru－Gly、0．022 03g Fru－Ala、0．194 90g Fru－Pro、0．015 82g Fru－Thr、0．010 05g Fru－Glu，0．031 24g Fru－Amb，用70％甲醇水溶液溶解，定容至50mL容量瓶中，配制成混标储备液。分别用移液管移取0．10、1．0、3．0、5．0、7．0、9．0、10．0mL混标储备液于10mL容量瓶中，用70％甲醇水溶液定容，得到一系列不同浓度的标准溶液。按1．4节条件进行测定，分别以相应的Amadori化合物离子峰面积y对浓度x拟合线性方程，相关系数r均大于0．995 0，各组分的线性方程、线性范围、检出限、定量限列于表4。

2．4 回收率和精密度实验

准确称取2．000g烟叶样品，按照1．3节方法进行处理，按1．4节条件进行分析，测定6种Amadori化合物的含量，平行测定5次，计算平均含量及RSD1，结果列于表5。

采用实际样品添加标样的方法测定回收率。取2．000g烟叶样品粉末，分别加入一定量的Amadori化合物标样，按1．3节和1．4节的方法进行处理与分析，并根据6种Amadori化合物的原含量、加标量和测定量计算回收率和RSD2，结果列于表5。

2．5 实际样品的测定

采用本方法对12个烟样进行测定，平行测定3次，取峰面积的平均值，通过外标标准曲线法计算相应的Amadori化合物含量，结果列于表6。

图2 六种Amadori化合物的SRM色谱图Fig．2 SRM chromatogram of 6 kinds of Amadori compounds

表4 线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 4 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantification

表5 回收率与精密度结果（n＝5）Table 5 Results of recovery and precision（n＝5）

表6 实际样品测定Table 6 Determination of actual samples

3 结论

建立了LC－MS／MS同时测定烟草中6种Amadori化合物的定性和定量分析方法。优化了前处理提取方法，确定的最优萃取条件为：萃取剂为70％甲醇，超声功率120W，超声时间25min，料液比1∶30；6种Amadori化合物的测定线性关系良好，相关系数r均大于0．995 0；方法的检出限（LOD）为20．06～39．86μg／kg，定量限（LOQ）为66．85～132．9μg／kg，平均回收率在86．56％～88．86％之间，相对标准偏差均小于5％。该方法的前处理简单、定量限低，回收率和精密度均能满足烟草中Amadori化合物的分析要求，可为我国烟草行业香味前体物质的研究提供技术支持。

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Simultaneous Determination of Six Kinds of Amadori Compounds in Tobaccos by LC－MS／MS

JIA Chun－xiao1，XIU Long－fei2，MOU Ding－rong3，MAO Duo－bin2
（1．College of Material and Chemical Engineering of Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450002，China；2．College of Food and Bioengineering of Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450002，China；3．Research and Development Center of Hongta Tobacco（Group）Corporation．，Ltd，Yuxi 653100，China）

A liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）method for qualitatively and quantitatively analyzing six kinds of Amadori compounds（Fru－Gly，Fru－Ala，Fru－Pro，Fru－Thr，Fru－Glu and Fru－Amb）in tobaccos was developed．The sample was extracted with 70％methanol water solutionsand assisted by ultrasound，and the extraction conditions which were optimized by orthogonal experiment as followings：the solid liquid ratio was 1∶30，the extraction power was 120W，and the extrac－

tobacco；liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）；Amadori compounds

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0045－07

10．7538／zpxb．youxian．2014．0052

2014－03－10；

2014－04－24

国家自然科学基金（21176229／B060804）；中国烟草总公司卷烟增香保润重大科技专项（110201101025（BR－07）资助

贾春晓（1965—），女（汉族），河南南阳人，教授，从事天然产物和烟草化学方面研究。E－mail：jiachx＠zzuli．edu．cn

毛多斌（1962—），男（汉族），河南南阳人，教授，从事烟草化学和有机合成方面研究。E－mail：maoduobin＠zzuli．edu．cn

时间：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0052．html

tion time was 25min．The extraction products from tobaccos were cleaned up by hexane and then analyzed by LC－MS／MS under the selected reaction monitoring（SRM）mode．The contents of six kinds of Amadori compounds were determined by external standard curve method．The results show that the limits of detection（LOD）are 20．06－39．86μg／kg，and limits of quantity（LOQ）are 66．85－132．9μg／kg．The correlation coefficients are greater than 0．995 0，the average recoveries are 86．56％－88．86％，and the relative standard deviations（RSD）are less than 5％．This method is simplify，sensitive and accurate，which is suitable for qualitative and quantitative analysis of Amadori compounds in tobaccos．