肝移植并免疫抑制剂联合用药后人血清差异蛋白质的鉴定

李 彦，刘 锋，王鸿丽，梁 艳，刘 煜，杨松成，何 昆

（1．武警总医院药剂科，北京 100039；2．国家生物医学分析中心，北京 100850；3．武警总医院肝脏移植研究所，北京 100039）

肝移植并免疫抑制剂联合用药后人血清差异蛋白质的鉴定

李 彦1，刘 锋2，王鸿丽2，梁 艳1，刘 煜3，杨松成2，何 昆2

（1．武警总医院药剂科，北京 100039；2．国家生物医学分析中心，北京 100850；3．武警总医院肝脏移植研究所，北京 100039）

建立了基于质谱技术的应用免疫抑制剂肝移植后人血清中差异表达蛋白质的分析方法。肝移植前后的人血清用双向凝胶电泳分离，硝酸银染色，选取的差异蛋白质斑点用表面活性剂Rapigest SF变性和胰蛋白酶进行胶内酶解后，采用纳升超高效液相色谱－电喷雾串联质谱（nanoUPLC－ESI－MS／MS）进行鉴定。本实验明确鉴定了9个显著差异表达的蛋白质斑点，对应8个不同的蛋白质，所发现的差异蛋白质多与免疫调节和肝病有关，可为深入研究肝移植术后免疫抑制剂抗排斥作用的分子机理提供线索。关键词：肝移植；血清；免疫抑制剂；纳升超高效液相色谱－电喷雾串联质谱（nanoUPLC－ESI－MS／MS）

肝脏移植术（liver transplantation）后如何减少免疫排斥反应等并发症，如何选择有效的治疗方法是目前肝移植领域中的重点问题［1－2］。免疫抑制剂FK506可用于治疗器官移植术后，其他免疫抑制药物无法控制的移植排斥反应，已成为临床抗排斥反应的首选药物，常与骁悉和激素联合治疗术后的抗排斥反应，但其体内作用机制还在研究中。近几年，蛋白质组学技术在发现药物靶点、阐明药物作用机理等方面发挥了极大的优势［3－4］，但还未见免疫抑制剂在肝移植后抗排斥作用的蛋白质组学方面的报道。本研究利用纳升超高效液相色谱－电喷雾串联质谱（NanoUPLC－ESI－MS／MS）技术对二维凝胶电泳分离的肝移植前和移植后，服用免疫抑制剂治疗表达显著的差异蛋白质斑点硝酸银染色后进行鉴定，以期为从蛋白质组学角度探索FK506联合用药抗排斥反应的作用机制提供线索。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Synapt G2质谱仪（nanoUPLC－ESI－MS／MS），Rapigest SF：美国Waters公司产品；经修饰的测序级胰蛋白酶（Trypsin）：德国Roche公司产品；牛血清白蛋白（BSA）等：美国Sigma公司产品。

1．2 样品

5例移植前和移植后24h、10d、30d、90d、180d的血清样品：来自武警总医院肝移植研究所的乙肝肝硬化肝癌移植病人，年龄27～65岁。移植后采用三联用药，即FK506＋骁悉＋激素，3个月时停用激素，FK506在3个月内浓度为8～10μg／L，3～6个月为6～8μg／L。

1．3 实验方法

1．3．1 传统胶内酶解方法［5］从双向电泳分离的银染色凝胶中切取差异蛋白质斑点，利用30mmol／L K3Fe（CN）6－100mmol／L Na2S2O3脱色液（1∶1，V／V）完全脱色，再用10mmol／L DTT和55mmol／L IAA进行还原和烷基化，然后加入0．01g／L胰蛋白酶液进行酶解，37℃孵育过夜，分别用5％TFA、2．5％TFA与ACN溶液（1∶1，V／V）和ACN，于37℃孵温1h后，提取肽段，真空离心干燥。

1．3．2 加入表面活性剂的酶解方法［6］脱色后，用10mmol／L DTT和55mmol／L IAA进行还原和烷基化，加入0．01g／L胰蛋白酶液和0．03％Rapigest SF进行酶解，于37℃孵育2h，肽段提取方法同传统方法。

1．3．3 质谱分析和数据库检索 用1％甲酸溶解样品，进样5μL。富集柱：Symmetry C18（180μm×20mm×5μm）；分析柱：nano Acquity UPLC超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱BEH C18（75μm×250mm×1．7μm）；柱温度35℃；流速200nL／min；流动相：含0．1％甲酸的水溶液（A）和含0．1％甲酸的乙腈（B）。

纳升电喷雾正离子数据采集模式：DDA方式，每次扫描2个强度最高的离子进行串联质谱分析；毛细管电压2 500V；锥孔电压35V；离子源温度90℃；采集范围：m／z350～1 600（一级质谱），m／z50～2 000（二级质谱）。通过数据库Mascot检索。

2 实验结果

2．1 传统酶解方法和加入表面活性剂变性酶解效率的比较

从凝胶上取同等量标准蛋白BSA条带，分成2组，分别用传统酶解方法和加入表面活性剂Rapigest SF酶解方法胶内酶解后进行nano UPLC－ESI－MS／MS分析，利用部分肽段测序进行Mascot数据库检索，结果列于表1。结果显示，加入Rapigest SF酶解方法的匹配肽段数、氨基酸覆盖率和检索分值比传统方法分别提高了约40％、30％、65％。因此，本研究的后续实验均采用加入表面活性剂的酶解方法。

2．2 差异蛋白质点的LC－ESI－MS／MS鉴定及数据库检索

凝胶上的表达差异蛋白质斑点，经nano UPLC－ESI－MS／MS分析和数据库检索，获得

差异蛋白质信息，结果列于表2。从9个差异蛋白质点鉴定出8个有意义的蛋白质，质谱的质量偏差均小于1×10－6。其中，蛋白质点487为表达下调蛋白，其余均为表达上调蛋白，点576和578鉴定为同一蛋白质haptoglobin Hp2，详细信息示于图1。

表1 两种酶解方法的LC－ESI－MS／MS分析结果比较Table 1 The comparison of two kinds of digestion methods

表2 nanoUPLC－ESI－MS／MS鉴定差异表达蛋白质Table 2 Identification of differentially expressed protein spots by nanoUPLC－ESI－MS／MS

2．3 讨论

本实验利用LC－MS／MS技术建立了免疫抑制剂FK506联合用药在肝移植后人血清差异表达蛋白质的鉴定方法。血清中高丰度蛋白质的浓度与低丰度蛋白质的浓度比值可达109倍，这使得许多低丰度蛋白在电泳中被掩盖。为获得更多蛋白质点信息，采用灵敏度低于1ng的硝酸银染色。而相对低的蛋白质浓度则直接影响蛋白质鉴定的灵敏度和可靠性。为提高银染凝胶中低丰度蛋白质的鉴定率，本研究使用酸性不稳定表面活性剂Rapigest SF来提高蛋白溶解率，浓度小于0．1％的Rapigest SF完全不影响胰蛋白酶的活性，且与质谱兼容。结果表明，加入表面活性剂能够明显提高银染色后蛋白质斑点的肽段提取率和氨基酸序列覆盖率，同时酶解时间可由原来的过夜缩短至2h。此方法与MALDI－TOF MS兼容性较差，不建议使用。鉴定的8个蛋白质多与免疫反应或肝病有关，如：Haptoglobin（Hp，结合珠蛋白）具有结合血红蛋白、促进血管生成和参与免疫反应等功能，体内结合珠蛋白数量明显的变化，有助于对肝脏疾病的诊断，判断疾病的预后［78］。有研究报道，Hp通过激活天然免疫能增强小鼠急性移植排斥反应［9］。Retinol－binding protein4（RBP4，视黄醇结合蛋白）是体内视黄醇从肝脏转运到靶组织的特异转载蛋白，肝功能受损，RBP表达会明显下调，血清中RBP的表达水平可以帮助评价肝脏功能的损害程度［10］。鉴定的这些差异点将为从蛋白质组学角度深入研究移植后，免疫抑制剂FK506联合用药抗排斥反应的作用机制、临床合理选择和使用免疫抑制剂等提供线索。

图1 nanoUPLC－ESI－MS／MS分析蛋白质斑点576Fig．1 The analysis of No．576 protein spot by nanoUPLC－ESI－MS／MS

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Identification of the Differentially Expressed Proteins in Human Serum after Liver Transplantation and Immunosuppressant Combination Therapy

LI Yan1，LIU Feng2，WANG Hong－li2，LIANG Yan1，LIU Yu3，YANG Song－cheng2，HE Kun2
（1．Department of Pharmacy，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing100039，China；2．National Center of Biomedical Analysis，Beijing100850，China；3．Institute of Liver Transplantation，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing100039，China）

The mass spectrometry method was established for analysis of differentially expressed protein in human serum after liver transplantation with immunosuppressive agent．The proteins in serum before and after liver transplantation were separated by two－dimensional gel electrophoresis with silver staining，the differentially expressed proteins on the gel were digested with surfactant Rapigest SF and trypsin and then identified by nanoUPLC－ESI－MS／MS．In the experiment，9differentially expressed protein spots were identified clearly，corresponding to 8different proteins．It was found that differentially expressed proteins are mostly related to immune regulation and liver dis－

liver transplantation；serum；immunosuppressive agent；nanoUPLC－ESIMS／MS

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0029－04

10．7538／zpxb．youxian．2014．0056

2013－12－23；

2014－06－23

武警总医院二类课题（wz2011019）资助

李 彦（1965—），女，副主任药师，从事药剂和临床药学研究。E－mail：lyanbjing＠126．com

何 昆（1973—），男，副研究员，从事蛋白质组学与细胞生物学研究。E－mail：hk＠proteomics．cn

时间：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0056．html

ease，and it may provide clues for the in－depth study the anti－rejection effect of immunosuppressive agent after liver transplantation．