茉莉花茶挥发性物质的SPME萃取条件优化研究

卢 健 傅得均 吴东芬 刘 瑜 骆耀平*

(浙江大学茶叶研究所，杭州310058;2.金华萌芽茶业有限公司，金华321042)

香气是茉莉花茶品质评价的重要因子，在花茶感官审评权重占40%［1］。因此，分析研究茉莉花茶中的挥发性物质，对于探究花茶的香气品质形成以及改进加工工艺具有重要的参考价值。前人对茉莉花茶挥发性成分研究时，多采用SDE法进行挥发性物质的提取［2-8］。但该法提取温度较高(影响受温度变化挥发性物质量的变化)，提取时间较长，过程繁琐。20世纪90年代初兴起的SPME法，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，具有样品用量少、选择性高、使用方便、快捷等优点，自问世来便广泛应用于气态、水体、固态样品中的挥发物和半挥发性有机物以及无机物的分析［9］，并已用于茶叶挥发性成分的萃取。该法对茉莉花茶挥发性物质进行萃取已有报道［10-13］，但SPME方法下对花茶挥发性物质的萃取条件不尽相同，结果差异较大。为使试验结果得到比较，借鉴前人的研究结果，探索利用SPME法萃取茉莉花茶挥发性组分的测定条件，为之后的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用传统二窨一提加工工艺窨制而成的茉莉花茶(为防止白兰花中挥发性物质对测定的干扰，未用其打底)。用于加工茉莉花茶的原料为福鼎大白茶品种加工而成的烘青毛茶，精制后作为加工花茶的茶坯。付窨用花为双瓣茉莉，采自金华市婺城区金店村。加工而成的茉莉花茶样以铝箔袋密封，保存于-20℃冰柜中待用。

1.2 试验试剂与主要仪器设备

试验用化学试剂为分析纯。正构烷烃混标(nalkane，C8-C20，Sigma-Aldrich，USA)。

SPME手持器(SAAB-57330U)和65 μm聚二甲基/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取头(美国Supelco公司);6890气相色谱-5973质谱仪(Agilent公司);50 mL顶空萃取瓶;BS124S电子天平(Sartorius公司);HH-2型可控数显恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 SPME萃取条件的优化 本试验采用能够更好保持完整香气信息的干茶法［14，15］，即直接将干茶置于萃取瓶中，封口膜密封后，插入萃取头进行萃取。根据"相似相溶"原理，分析前人试验结果，试验选用对极性挥发性物质萃取效果较好的65 μm PDMS/DVB萃取头。利用SPME法萃取挥发性物质，其效果受萃取纤维固定相、萃取温度、萃取时间、样品体积等因素影响［16］。本试验研究了试验用茶量、萃取温度和萃取时间三个因素对茉莉花茶萃取效果的影响。在试验因素的水平设置时，本试验除了对待优化因素设置不同水平外，其他因素参考了本课题组之前对绿茶挥发性物质确定的优化条件，用茶量依试验结果定。

(1)试验用茶量 茶叶中挥发性物质萃取研究中，不同茶类的用茶量从 2g 到 10g 不等［14，15］，依前人试验的结果，本试验选设 2.5 g、5 g、7.5 g 和 10 g四个处理，另选择本实验室已获萃取温度60℃、萃取时间40 min［17］的试验条件，置茶样于50 mL萃取瓶中，在60℃水浴条件下萃取40 min。

(2)萃取温度 已有研究绿茶、乌龙茶、黄茶、普洱茶和茉莉花茶中挥发性物质，所选萃取温度分别有 60℃、60℃、80℃、40℃和 50℃［15，17-20］。据此，本试验设 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五个处理。选择萃取时间40 min，试验用茶量依上一试验优化结果确定。

(3)萃取时间各地研究中对茶叶挥发性物质测定的萃取时间有较大差异，资料表明，所用时间从20 ～80 min 不等［14，15，17-20］，为此，本试验设 20 min、40 min、60 min、80 min四个萃取时间，选择萃取温度60℃，根据试验用茶量试验选择合适的用茶量。

1.3.2 挥发性化合物的气相质谱分析(GC/MS)SPME萃取完成后，将纤维头插入GC进样口，热解吸附3.5 min。每一样品重复3次。

GC条件:色谱柱为HP-innowax色谱柱(30 m×0.25 mm ID ×0.25 μm 膜厚);载气为高纯 He，流速1.0 mL/min;进样口温度为250℃，ECD检测器温度为250℃;初始柱温为50℃，保持5 min，以3℃/min升温至220℃，保持5 min，再以10℃/min升温至240℃，保持5 min，不分流进样。

MS条件:离子化方式为EI，离子源温度230℃，四级杆的温度150℃，电子能量70 eV，检测器电压350 V，色谱-质谱接口温度260℃，质量扫描范围为35 ～450 a.m.u.。

1.3.3 挥发性化合物的数据处理与分析 物质的谱库鉴定、MS峰鉴定及保留指数(RI)鉴定方法同林杰［15］。

以往对茉莉花茶挥发性物质的研究表明，茉莉花茶中芳樟醇、乙酸苄酯、α-法尼烯、苯甲酸顺-3-己烯酯、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚六种物质相对含量最大，约占全部挥发性物质的 85%［2］(SDE法)或79%［13］(SPME法)。在进行试验优化萃取条件时，选择该六种物质为主要比较对象。试验数据采用SPSS 16.0 统计软件包(Version 16.0 for Windows，SPSS Inc.Chicage，Ⅱ，2007)进行数据分析，平均值之间比较采用单因素方差分析，不同处理间差异采用Duncan法进行多重比较检验，显著性水平设定为α =0.05。

2 结果与分析

2.1 试验用茶量对萃取效果的影响

已有研究表明，茉莉花茶中芳樟醇、乙酸苄酯、α-法尼烯、苯甲酸顺-3-己烯酯、邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚六种挥发性物质相对含量约占全部挥发性物质的 85%［2］(SDE 法)或 79%［13］(SPME 法)，选择这六种物质分析比较，利于主要问题的剖析。不同试验用茶量与茉莉花茶中六种大量挥发性组分峰面积的关系如图1所示。结果表明，六种物质中，有些随用茶量增加，峰面积对数值变化小，有些超过一定用茶量后，峰面积对数值下降。芳樟醇和乙酸苄酯两种挥发性物质的峰面积对数值在各不同用茶量处理下变化小，处理间差异不显著。其它四种挥发性物质的峰面积对数值，在用茶量小于5 g范围内差异不显著;邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚的峰面积对数值，用茶量7.5 g时，与之前用茶量条件下差异不显著，用茶量10 g时显著低于5 g处理;α-法尼烯和苯甲酸顺-3-己烯酯，在用茶量超过5 g时，峰面积对数值下降，且与5 g用茶量差异显著。换言之，六种主要成分中，有两种成分的峰面积对数值在7.5 g与5 g处理间差异显著。由此认为，利用SPME检测茉莉花茶挥发性物质时，花茶挥发性物质中占80%以上的六种物质的萃取量，在用茶量2.5 g～5 g时变化较稳定。

图1 不同用茶量对茉莉花茶中六种香气成分萃取效果的影响

2.2 萃取温度对萃取效果的影响

SPME提取、富集样品的过程是一个动态平衡过程，温度通过影响挥发性物质在各相之间的分配系数，对萃取效果产生影响［16］。不同萃取温度条件下，六种主要挥发性物质的萃取效果如图2所示，由图可以看到，萃取温度60℃，是这六种挥发性物质峰面积对数值变化的转折点。α-法尼烯、邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚三种物质低于60℃时，峰面积对数值随温度升高而快速增加，各温度处理间差异显著，高于60℃时峰面积对数值变化量差异不显著;苯甲酸顺-3-己烯酯在60℃之前温度条件下萃取，峰面积对数值也是增加，且增加速度明显较前面三种物质快，50℃、60℃处理的峰面积对数值与前一处理相比分别增加了4.02%和3.75%(前面三种物质峰面积对数值增加最快的为3.26%);之后的温度处理下，仍有增加，但增加速率减缓，70℃、80℃处理的峰面积对数值与前一处理相比分别增加了1.16%和0.89%;其他两种物质在不同萃取温度处理下，峰面积对数值的变化表现为随萃取温度升高，峰面积对数值减少。其中，乙酸苄酯在60℃之前，曲线变化有下降趋势，显著性测定不显著，萃取温度高于60℃时，显著下降;芳樟醇在60℃之前下降快速，之后，变化不显著。根据这六种挥发性物质的综合变化，萃取温度60℃时，这些挥发性物质处于一个较高或较稳定的位置，因此，利用该方法的萃取温度选择60℃合适。

图2 萃取温度对萃取效果的影响

2.3 萃取时间对萃取效果的影响

不同萃取时间与茉莉花茶中六种大量挥发性物质峰面积变化关系如图3所示，可以看出，随萃取时间的增加，六种挥发性物质的峰面积对数值先增加，40 min时，峰面积对数值处于较高位置，增加较多的α-法尼烯、苯甲酸顺-3-己烯酯、邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚四种物质的峰面积对数值与20 min时相比，分别增加了 2.41%、3.61%、1.86% 和 1.36%。40～60 min六种挥发性物质的峰面积对数值处于一个相对稳定的变化中，80min时略有下降。在试验处理时间内，乙酸苄酯峰面积对数值变化不显著。芳樟醇峰面积对数值随时间的延长有下降趋势，20 min处理和80 min处理下差异显著，其他时间处理下差异不显著。其他四种挥发性物质峰面积对数值随萃取时间延长有较一致的变化。萃取时间为20～40 min时，四种挥发性物质峰面积对数值显著增加;萃取时间超过40 min，苯甲酸顺-3-己烯酯的峰面积对数值仍增加，但趋势减缓，萃取60 min时与40 min萃取结果差异显著;其它三种挥发性物质在40～80 min范围内变化差异不显著。

HS-SPME萃取过程是待测物在介质相、顶空相和萃取纤维相的分配平衡过程，要达到动态平衡需要一定的时间。由试验结果可以看到，萃取时间在20～40 min(包括40 min)范围内，α-法尼烯、苯甲酸顺-3-己烯酯、邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚四种挥发性物质的峰面积对数值随时间的增加显著增加;萃取时间40～60 min，六种挥发性物质的峰面积对数值处于一个相对稳定的变化中，80 min时略有下降。因此，萃取时间以40～60 min为合适。

3 讨论

茉莉花茶中已提取分析得到七十种以上挥发性物质［15］，是一个多组分、多相的混合系统，这些物质的挥发性强弱、沸点等性质不同，被茶坯吸附的能力不同，有些吸附后不易分离，有些则相反，随时间、用茶量、温度等变化，这些性质都会得到反映。

图3 萃取时间对萃取效果的影响

试验条件下，占挥发性物质约80%的六种物质，不同用茶量处理时，以用茶量2.5～5 g时物质变化较为稳定，超过5 g用茶量，差异较大，可见并非是用茶量越多萃取效果越佳。以往一些研究有10 g用茶量处理，此时，主要的六种物质中有四种挥发性物质(α-法尼烯、苯甲酸顺-3-己烯酯、邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚)与用茶量小时(5 g)差异显著，与相邻处理也有较大差异。因此，试验用茶量以2.5～5 g为合适。

萃取温度优化试验结果表明，当萃取温度在60℃以下时，六种主要物质峰面积对数值还处于较大的变化之中，60℃ ～80℃时，变化较小。由此认为，60℃ ～80℃温度范围内萃取是合适的温度条件，但在合适温度范围条件下，较低温度对因不同温度变化而带来影响的挥发性物质的保持有利［14］，据此，优先选择萃取温度条件为60℃。

不同萃取时间内，主要的六种挥发性物质量都有不同的变化，萃取时间40～60 min范围内，六种挥发物质峰面积随时间变化趋缓。因此，萃取时间以40～60 min为宜。

物质的饱和蒸汽压越大，挥发性越强。六种主要挥发性物质中，芳樟醇和乙酸苄酯的饱和蒸汽压高于其它四种物质［21］，推知芳樟醇和乙酸苄酯比其它四种物质的挥发性强。此外，芳樟醇和乙酸苄酯的沸点低于其它四种物质。因此，不同温度、时间优化时可以看到这两种物质的含量均在较短时间和较低温度下达到较高水平。

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