人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达①

王艳，陈庆状，蒋德旗，李明星，贾思远，朱宁，王勇

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达①

王艳1a，陈庆状2，蒋德旗1a，李明星1a，贾思远1b，朱宁3，王勇1a

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体，观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因，连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域，构建重组穿梭质粒pHBAd-MCM-HSP75-GFP，在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞，整合包装成重组腺病毒，TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定，HSP75基因已正确插入穿梭质粒中，并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒；重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml；Western blotting检测，转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论HSP75重组腺病毒载体成功构建，对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。

热休克蛋白75；重组腺病毒载体；C17.2神经干细胞

[本文著录格式]王艳，陈庆状，蒋德旗，等.人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达[J].中国康复理论与实践,2015,21(3):264-268.

CITED AS:Wang Y,Chen QZ,Jiang DQ,et al.Construction of adenovirus vector carrying human HSP75 gene and expressing in C17.2 neural stem cells[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):264-268.

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以认知功能进行性下降和情感障碍为特点的神经退行性疾病，临床上早期主要表现为记忆力减退、生活自理能力下降，最终导致进行性认知功能缺失、生活自理能力完全丧失和神经行为异常[1-2]。其中β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)介导的炎性反应导致脑内微环

境改变是AD主要的原因之一[3-5]。线粒体是炎性因子损伤的主要靶点[6-7]，保护神经细胞线粒体成为治疗AD的重要途径。

神经干细胞具有自我维持和更新、分裂增殖和多向分化的潜能[8-9]。干细胞移植是近几年来治疗神经退行疾病的重要手段，特别是对AD的康复治疗颇具前景[10]。热休克蛋白75(heat shock protein 75,HSP75)是主要定位于线粒体的伴侣蛋白[11]，参与了多种生理功能的调控，包括细胞存活、细胞增殖、线粒体合成及胞内蛋白的转运等，在神经系统疾病中发挥了重要的作用[12-13]。本研究构建HSP75基因的复制缺陷型腺病毒载体，转染体外培养的神经干细胞，为基因工程化神经干细胞移植治疗AD提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

含HSP75基因的质粒、穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP、骨架质粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre、LipofiterTM转染试剂、HEK293细胞、PCR引物均购自汉恒生物科技有限公司。C17.2神经干细胞由上海交通大学金卫林教授馈赠。大肠杆菌菌株DH5α购自TIANGEN公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA ladder购自FERMENTAS公司。DMEM、胎牛血清、马血清购于GIBCO公司。质粒DNA抽提试剂盒购于康为世纪公司。凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。HSP75多克隆抗体、nestin小鼠单克隆抗体购自ABCAM公司。β-actin小鼠单克隆抗体购于碧云天生物技术研究所。

1.2 人HSP75基因的扩增

取含人HSP75基因的质粒0.5µl为模板进行PCR扩增，上游引物5'-ACA CGG ATC CAT GGC GCG CGA GCT GCG GGC GC-3'；下游引物5'-ACA CGA ATT CTC AGT GTC GCT CCA GGG CC-3'，由汉恒生物科技公司合成。循环条件：95℃预变性5 min，94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸90 s，循环25次，72℃延伸10 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.3 重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-HSP75-GFP的构建与鉴定

HSP75的PCR扩增产物和穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP分别经BamHI和EcoRI双酶切，回收相应片段，经T4DNA连接酶连接后，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选氨苄青霉素阳性克隆。获得的菌液进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的pHBAd-MCMV-HSP75-GFP质粒送公司测序。

1.4 重组腺病毒的制备、鉴定及滴度测定

用质粒抽提试剂盒提取菌液中的重组穿梭质粒。将重组穿梭质粒和骨架质粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre通过LipofiterTM转染试剂共转染HEK293细胞，观察细胞生长状况，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。液氮及37℃水浴反复冻融3次，离心收集病毒上清液作为第1代毒种(P1)，将P1病毒感染HEK293细胞再次进行扩增，收集病毒上清液保存于-80℃。取病毒50µl，加入蛋白酶K 2µl，56℃温育1 h，煮沸10 min，冰浴；取1µl为模板行PCR鉴定。采用TCID50法测定病毒滴度。

1.5 神经干细胞的培养及鉴定

C17.2神经干细胞置于含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM高糖培养基中，于5%CO2培养箱中37℃培养。收集C17.2细胞悬液，接种在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，待细胞生长至约80%时，4%多聚甲醛固定，10%山羊血清封闭，滴加nestin一抗过夜孵育。次日，依次滴加FITC山羊抗小鼠IgG二抗和DAPI室温孵育，荧光显微镜下观察拍照。

1.6 重组腺病毒转染神经干细胞和HSP75蛋白的表达检测

将C17.2细胞以2×105/孔接种于六孔板，置于5% CO2培养箱中37℃培养，12 h后去除培养基，PBS洗2次，添加感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100的病毒液和无血清DMEM高糖培养基1 ml，2 h后换含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM高糖培养基2 ml继续培养。36 h后，用荧光显微镜和流式细胞仪观察GFP表达情况和病毒感染率。用细胞裂解液处理细胞，离心后取上清，BCA法测蛋白质含量，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白半干转至PVDF膜上，封闭液封闭；加HSP75多克隆抗体和β-actin小鼠单克隆抗体，加辣根过氧化物酶结合的二抗，ECL法显色后扫描。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 人HSP75基因扩增的PCR产物鉴定

在2100 bp处可见特异性片段，大小与目的片段预期相符(图1)。

2.2 重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-HSP75-GFP的鉴定

得到5300 bp和2100 bp左右两条带(图1)，与预期结果一致，该质粒鉴定正确。测序结果与目的序列完全匹配。

2.3 重组腺病毒的鉴定及滴度测定

以重组腺病毒原液为模板进行PCR，2100 bp处能够扩增出预期条带(图1)。采用TCID50进行滴度测定，病毒的滴度为1.0×1010PFU/ml。

2.4 C17.2细胞形态学及免疫细胞化学鉴定

C17.2细胞在普通显微镜下，细胞形态不规则，呈扁平的形态，细胞边界不清，并与邻近的细胞相互接触，多次传代后细胞的生长和形态无明显改变(图2)。行nestin免疫细胞化学染色，全部细胞均呈nestin抗原阳性(图2)。

2.5 重组腺病毒对C17.2细胞的转染和HSP75蛋白的表达

荧光显微镜观察GFP的表达，证实大部分细胞已被病毒感染(图3)。流式细胞仪检测腺病毒转染率，感染率85%左右(图4)。Ad-HSP75-GFP感染组与正常组(Normal)和Ad-GFP处理组相比，Ad-HSP75-GFP组的HSP75蛋白表达量增加(P＜0.05)(图5)。

3 讨论

HSP75基因是调控线粒体功能的关键基因，它除了参与线粒体内相关蛋白的合成转运外，还能通过参与调节线粒体通透性转换孔的开放，降低对细胞的损害[14]。因此HSP75基因成为治疗与线粒体疾病密切相关的AD[15]的重要研究方向。

我们前期研究表明，脑内Aβ介导的炎性反应影响了神经干细胞的增殖[16]，移植外源性神经干细胞是治疗AD的策略之一。本研究选取C17.2神经干细胞作为HSP75基因转染的靶细胞，该细胞适合作为基因治疗的载体细胞，特别适用于神经退行性疾病的干细胞移植治疗[17-19]。

基因治疗载体可分为非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体主要以质粒载体为代表。质粒载体在阳离子型脂质体的辅助下进入靶细胞，操作虽然简单，但转染效率较低、对细胞的毒性较大。腺病毒载体是目前应用最为广泛的基因治疗载体，它对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力。它通过受体介导的内吞作用进入细胞，将腺病毒基因组转移至细胞核中，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组[20]。目前已有重组腺病毒载体与干细胞的相关研究[21-22]。

图1 重组腺病毒构建过程的鉴定

图2 C17.2神经干细胞的形态学观察和免疫鉴定(200×)

图3 转染后干细胞GFP表达(荧光显微镜,100×)

图4 重组腺病毒在C17.2细胞的转染率

图5 HSP75蛋白表达

由于干细胞是相对静止的细胞，利用脂质体转染效率较低，毒性也较大。本研究采用MICROBIX公司由Frank L Graham教授建立的高转染效率、低毒性的AdMax腺病毒包装系统。将携带HSP75质粒和携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染HEK293细胞，利用重组酶系统产生重组腺病毒，不经纯化的病毒滴度可达1010PFU/ml，足以用来感染靶细胞。实验结果也表明，构建的重组腺病毒转染C17.2神经干细胞，转染率较高；Western blotting检测发现，转染HSP75基因的神经干细胞可以有效表达HSP75蛋白。

HSP75基因重组腺病毒的成功构建，为阐明AD的病理机制和基因治疗奠定了实验基础。在后续干细胞移植治疗AD研究中将进一步探讨。

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Construction ofAdenovirus Vector Carrying Human HSP75 Gene and Expressing in C17.2 Neural Stem Cells

WANG Yan,CHEN Qing-zhuang,JIANG De-qi,LI Ming-xing,JIA Si-yuan,ZHU Ning,WANG Yong
1.a.Department of Pharmacy;b.Department of Burns,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong 510282,China;2.Department of Pharmacy,Guangzhou Hospital of Integrated Traditional and West Medicine,Guangzhou,Guangdong 510800,China;3.Department of Pharmacy,the Third People's Hospital of Nanhai, Foshan,Guangdong 528244,China

Objective To construct recombinant adenovirus vector carrying the human HSP75 gene and detect its expression in C17.2 neural stem cells.Methods HSP75 gene was amplified from plasmid carrying the human HSP75 gene and inserted to the polyclonal site of adenovirus shuttle plasmid pHBAd-MCMV-GFP.HEK293 cells were co-transfected with the constructed recombinant shuttle plasmid pHBAd-MCMV-HSP75-GFP and large adenovirus helper plasmid pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre in mediation of LipofiterTM.The recombinant adenovirus was obtained and the viral titer was examined using the method of TCID50.The transfection and expression of HSP75 was detected by fluorescence microscope,flow cytometer and Western blotting.Results Restriction digestion,sequencing analysis and PCR amplification revealed the successful construction of recombinant shuttle plasmid and recombinant adenovirus.The titer of recombinant adenovirus was 1.0×1010PFU/ml.Western blotting indicated HSP75 gene could be expressed effectively in neural stem cells after transfection.Conclusion The recombinant adenovirus vector carrying HSP75 gene was successfully constructed and can be expressed after transfected in C17.2 neural stem cells.

heat shock protein 75;recombinant adenovirus vector;C17.2 neural stem cells

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.005

R741

A

1006-9771(2015)03-0264-05

2014-12-09

2015-02-16)

1.国家自然科学基金项目(No.30973162)；2.广东省自然科学基金项目(No.S2012010008199；No.S2013010015546)。

1.南方医科大学珠江医院，a.药剂科；b.烧伤科，广东广州市510282；2.广州市中西医结合医院药剂科，广东广州市510800；3.南海区第三人民医院药剂科，广东佛山市528244。作者简介：王艳(1989-)，女，汉族，广东河源市人，硕士研究生，主要研究方向：阿尔茨海默病的基础研究。通讯作者：王勇，男，博士，教授。E-mail:yongwh2005@163.com。