FCM 和细胞遗传学检查在恶性淋巴瘤诊断中的意义

钱卫清 陈梅玉 仇惠英 郑积富 魏计锋 朱明清 岑建农 潘金兰 孙爱宁 吴德沛

恶性淋巴瘤是淋巴结和结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，目前淋巴瘤的诊断主要依靠病理切片检查。但是恶性淋巴瘤的诊断和分型一直是病理学有争议的领域之一，尤其是非霍奇金淋巴瘤组织学的改变复杂，与淋巴结的多种良性病变在常规染色形态学多有交叉，一定情况下鉴别困难，误诊率较高。本研究在常规染色形态学检查同时，采用流式细胞术联合细胞遗传学检查，以提高恶性淋巴瘤的确诊率，现将结果报道如下。

材料与方法

1.标本来源:笔者医院2008 ～2011 年29 例门诊及住院疑似淋巴瘤患者淋巴组织标本，其中男性23 例，女性6 例，患者年龄13 ～80 岁，中位年龄58 岁。本研究29 例标本全部采用病理学检查和流式细胞术测定，其中24 例标本另外采用细胞遗传学检查。

2.流式细胞术检测:标本的制备:新鲜的淋巴组织标本置于生理盐水中，剪切成直径2 ～3mm 的小块，放在特制的带旋转刀片的盒子中，加1ml 生理盐水，以一定的速度旋转刀片2～3min，将组织分散成单个细胞或极小的组织块，然后用50μm 直径的尼龙网过滤后，再用含0.1%牛血清白蛋白的PBS 低速(1000 ～1200r/min)离心5min，洗涤两次，悬浮单个核细胞在洗液中备用。采用多个细胞系列的抗体(T 系、B系、髓系)和细胞发育早期和后期的抗体，利用三色免疫荧光染色，CD45/SSC 设门鉴别幼稚和成熟细胞，获得较多参数分析。具体步骤如下:使用流式细胞仪，开机后以CaliBRITE3荧光微球和FACSComp 自动检查仪器灵敏度，并自动设定实验的获取条件，包括PMT 电压和荧光补偿等，然后进入Multi-SET 自动分析软件或CellQuest 分析软件，按软件的提示自动或手动设置各T 淋巴细胞亚群门，获取15000 个细胞，自动分析各样本管淋巴细胞免疫表型。

3.细胞遗传学检测:所有标本按照常规方法制备染色体标本及R 显带进行细胞遗传学检查。按上述方法制备细胞悬液后置37℃恒温箱培养24h，早晚定期摇匀培养物1 次。于终止培养前1h 加入秋水酰胺，终浓度为0.05μg/ml，阻留中期分裂相。将培养物1000r/min 离心10min，弃去上清，沿管壁缓慢加入37℃的0.075mol/L 的KCl 溶液6 ～8ml，混匀后至37℃恒温箱30min。然后加入3∶1 甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混匀，1000r/min 离心10min 后弃上清，加新鲜配置的3∶1甲醇、冰醋酸固定液6 ～8ml，吹打混匀后再次离心10min，重复上述两步，使细胞经过3 次固定，制成合适浓度的细胞悬液。用吸管将细胞悬液吸取少量，从10cm 高处滴至一端倾斜15°的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上，每张玻片2 ～3 滴，过火数次后使其干燥。将干燥的玻片放入预温87.5℃的Earle's 溶液中，温浴时间在60 ～120min 之间。然后用新鲜配制的10%Giemsa 染色液染色8 ～10min，取出水洗待干。核型异常根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2009)》的规定进行描述。正常核型者至少分析20 个分裂象，异常核型者至少分析10 个分裂象，2 个或2 个以上具有相同的核型异常定为异常克隆。

4.结果判定标准:FCM 测定免疫表型分析参照WHO 2000 年恶性淋巴瘤分类法［1］。核型异常命名根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2009)》［2］的标准。

结 果

1.29 例患者最终诊断:29 例患者按照恶性淋巴瘤WHO 分类法最终诊断弥漫大B 细胞淋巴瘤6 例，间变大B 细胞淋巴瘤2 例，外周T 细胞性淋巴瘤2例，霍奇金淋巴瘤1 例，B 淋巴母细胞淋巴瘤1 例，T细胞血管免疫母细胞淋巴瘤3 例，嗜酸细胞白血病1例，纵隔淋巴结大细胞癌1 例，巨球蛋白血症1 例，脾边缘区淋巴瘤1 例，淋巴浆细胞淋巴瘤1 例，套细胞淋巴瘤2 例，滤泡性淋巴瘤3 例，未能明确分型的淋巴瘤4 例。其中有8 例病理诊断为反应性增生或慢性炎症，通过流式细胞仪和细胞遗传学检测而最终确诊为外周T 细胞淋巴瘤1 例，霍奇金淋巴瘤1 例，T细胞血管免疫母细胞淋巴瘤1 例，滤泡性淋巴瘤1例，嗜酸性白血病1 例，巨球蛋白血症1 例，未明确分型的淋巴瘤2 例。

2.流式细胞仪对淋巴瘤诊断作用:流式细胞仪对表面抗原检测，如果分析发现较多细胞群体有克隆性B 淋系或T 淋系，往往提示有恶性克隆的存在。另外可区分B 淋系还是T 淋系，7 例为T 淋系抗原表达，如例22，流式细胞仪检测到CD30 阳性的成熟异常T淋系表达，而且染色体也发现异常，最终诊断T 细胞淋巴瘤。通过不同抗原检测对区分不同亚型有指导意义，如例6 有强阳性CD20 表达，与病理切片提示滤泡性恶性淋巴瘤相符合，提示临床上可采用抗CD20 单抗美罗华治疗;例9 流式检测符合MCL 表型，同时染色体也发现t(11;14)，支持套细胞淋巴瘤诊断。

3.核型分析意义:12 例患者检测到异常核型，其中4 例淋巴结病理提示淋巴结炎或者增生但核型发现异常染色体改变，肯定了为恶性改变。例9 和例13 检测到t(11;14)(p13;q11)，而例9 病理检查为成熟克隆性B 淋巴细胞，流式细胞仪也检测到异常的淋系表达符合套细胞淋巴瘤CD5+、CD10-、CD23-，核型分析肯定了套细胞淋巴瘤的诊断，例13 病理诊断为T 淋巴母细胞性淋巴瘤，核型分析也肯定了病理诊断。例28 核型检测到t(14;18)(q32;q21)，该易位是滤泡性淋巴瘤的特征性改变，但是病理提示右颈淋巴结反应性增生，最后临床诊断滤泡性淋巴瘤，经过美罗华联合CHOP 方案治疗得到缓解。核型分析显示9 例患者为复杂核型，提示预后不良。

讨 论

恶性淋巴瘤分为霍奇金病和非霍奇金病两大类，临床以无痛性淋巴结肿大为典型特征，晚期有恶病质、发热及贫血。淋巴瘤的发生率近年来呈上升的趋势，病死率为1.5/10 万，占所有恶性肿瘤死亡位数的第11 ～13 位。淋巴瘤诊断依据淋巴组织活检，通过病理切片形态和免疫病理诊断。流式细胞术是一种高通量的主要针对细胞的检测方法，通过物理特性和其他荧光标记方法达到对细胞分类筛选的目的。染色体异常与一些特异淋巴瘤类型有关，如套细胞淋巴瘤可见t(11;14)(q13;q32)，间变性大细胞淋巴瘤中可见t(2;5)(q23;q32)，Burditt 淋巴瘤有t(8;14)(q24;q32)，滤泡性淋巴瘤可见t(14;18)(p32;q21)。但因淋巴瘤诊断很多情况下在各个科室因怀疑其他疾病比如扁桃腺肿大、鼻咽部肿瘤或者胃肠道肿瘤行手术切除，病理切片后诊断，而标本已经固定石蜡包埋，无法再次得到新鲜标本行染色体和流式细胞仪检查，另外有时因取材较少比如是穿刺标本或者小淋巴结，不能实施多种方法检测，因此目前国内较少同时开展淋巴组织的分子生物学的多项检测。笔者在3年期间有意识留取29 例疑似淋巴瘤的病例，结果显示标本中病理学检查与FCM 检查结果符合的有21例(72.4%)，不符合的有8 例(27.6%)。

虽然病理学检查是疾病诊断的金标准，但是病理学检查镜下分析细胞少，同时受到主观判断影响，不难发现病理学检查对淋巴瘤的诊断存在一定的漏诊率和误诊率;而且单纯的形态学检查只能描述恶性细胞在淋巴结的位置和特殊形态，无法提示分化阶段，对临床医生治疗方案的选择以及患者的预后评估也不能提供有效的依据。Lanne 等［3］通过组织样本穿刺的方法获得424 例淋巴组织样本，采用免疫组化和流式细胞术方法检测，证实两种检测方法对低度恶性B-NHL 的一致性为95%，淋巴滤泡增生为97%，而高度恶性的B-NHL 及T-NHL 一致性稍低，分别为78%及53%。NHL 是恶性淋巴系单克隆增生，80%起源于B 细胞，20%起源于T 细胞或非B 非T 细胞。FCM 通过激光照射细胞产生FSC 和SSC 来区分细胞群体，其中FSC 的数值和细胞大小呈正比，SSC 的数值和细胞颗粒度的多少呈正比。

免疫荧光法测定细胞表面抗原对淋巴瘤的免疫分型有重要的意义。例如套细胞淋巴瘤(MCL)为B淋巴克隆性疾病，表达CD19、CD20、CD22、CD43，IgM 中度表达，IgD 弱表达或阴性，多数病例CD5+/CD23-、CD10 阴性。滤泡性淋巴瘤(FL)CD19、CD20、CD22 阳性，经常表达CD23、FMC7、CD10，缺乏CD5、CD43、CD11c 和CD103，因此可以利用细胞表面抗原表达的特异性进行淋巴瘤类型的区别。本研究中1 例套细胞淋巴瘤患者染色体检查出t(11;14)异常并伴有其他染色体异常的复杂核型，这与多数学者所报道的MCL 具有t(11;14)(q13;q32)特异的细胞遗传学改变是符合的。t(11;14)(q13;q32)改变引起BCL-1/PRAD -1 重排，导致原癌基因CyclinD1蛋白的表达。Bosch 等报道PRAD - 1/CyclinD1 是MCL 敏感及特异的的分子标志，FCM 检测该蛋白可以为MCL 提供诊断依据，因病例数少笔者未开展此项检测。有报道证实，淋巴瘤的标本产生特异的细胞群的概率与炎性增生等非淋巴瘤标本产生特异细胞群的概率比具有统计学的意义，但是不能排除淋巴结内细胞种类多而复杂，特异细胞较少产生的假阳性和假阴性结果，所以FCM 不能取代病理学检查。

Colorado 等［4］对223 个淋巴组织标本进行检测，发现FCM 敏感度和特异性分别为87. 25% 和95.95%，对霍奇金淋巴瘤和富于T 细胞/组织细胞大B 细胞淋巴瘤的诊断，FCM 诊断较为困难，这可能与两者的生物学特性相似，＜10%的克隆性B 细胞亚群会伴随有T 淋巴细胞毒性的改变。排除霍奇金淋巴瘤后，FCM 诊断的敏感度明显提高。病理上确诊的淋巴瘤患者考虑骨髓或中枢侵犯，可行骨髓或脑脊液FCM 检测可以明确诊断，尤其是区分细胞发育早期和晚期，淋巴母细胞淋巴瘤、ALL 均是淋巴细胞发育早期阶段，相应的早期抗原和系列抗原阳性。弥漫性大细胞淋巴瘤和弥漫性小无裂细胞淋巴瘤是淋巴细胞发育晚期阶段的肿瘤，相应的晚期抗原和系列抗原阳性。

一项多中心研究报道，对174 例初诊高危NHL患者行FCM 及脑脊液细胞学检测，FCM 发现10%(18/174)患者脑脊液阳性，而细胞学检测4%(P ＜0.001)［5］。FCM 检测脑脊液阳性的患者无论两年无病生存率及总生存率均低于阴性患者。对高危NHL患者通过FCM 行脑脊液检查降低中枢神经系统复发及改善预后有重要意义。而Alvarez 等［6］也做了相应的研究，认为虽然FCM 检测比传统的细胞学更为敏感和特异，但是并未减低中枢神经系统的复发率。而染色体检查对淋巴瘤的诊断有进一步补充的作用。不同的淋巴瘤有特异的性的染色体改变，如t(14;18)(q32;q21)和t(11;14)(q13;q32)分别有助于FL和MCL 的诊断［4］。许多染色体的异位又引起一些新的融合基因和蛋白表达，这些融合基因和蛋白反应淋巴瘤的发生机制，对淋巴瘤的诊断和分型，特别是形态学和免疫学难以确定的病例的诊断和分型有重要意义。

本研究通过3 种方法组合检测对29 例患者进行了精确的分类，各种类型均有，这单凭病理学检查是做不到的。特别是8 例病理诊断为反应性增生或慢性炎症，通过流式细胞仪和细胞遗传学检测而最终确诊为外周T 细胞淋巴瘤1 例，霍奇金淋巴瘤1 例，T细胞血管免疫母细胞淋巴瘤1 例，滤泡性淋巴瘤1例，嗜酸性白血病1 例，巨球蛋白血症1 例，未明确分型的淋巴瘤2 例，避免了漏诊。流式细胞仪对表面抗原检测可以发现是否有克隆性B 淋系或T 淋系异常表达，本研究病例7 例(24.1%)为T 淋系抗原表达与文献报道的80%起源于B 细胞，20%起源于T 细胞或非B 非T 细胞结果相类似，同样FCM 检测到一些病例有强阳性CD20 表达，为治疗上选择抗CD20单抗提供了依据。本研究细胞遗传学核型分析12 例患者检测到异常核型，肯定了患者为恶性改变，同时一些特异性染色体改变如t(11;14)(p13;q11)和t(14;18)(q32;q21)对特定亚型诊断具有重要意义。

本研究结果显示，淋巴组织病理学检查是诊断恶性淋巴瘤的基础，结合流式细胞术以及染色体检查可以提高恶性淋巴瘤的诊断率，并对淋巴瘤亚型分型以及预后判断具有指导意义，值得临床开展。

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