脑缺血再灌注损伤治疗的实验研究进展

王富明 徐 虹 孙 华

脑卒中是最常见的一种疾病。根据2013 年《中国卫生和计划生育统计年鉴》，脑血管疾病可能引起高病死率和致残率，已经位居中国城市居民死亡原因的第3 位，对人类的健康造成了严重威胁。大约80% ～85%的脑卒中患者属于缺血性脑卒中［1］。因此探索脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)的机制和找到有效的治疗手段是目前的研究重点。组织纤溶酶原激活物TPA 是目前唯一的FDA 批准的治疗脑缺血的药物，主要作用于堵塞的血管再通并使之再灌注，但因其适应证、禁忌证的限制，导致临床上多数患者无法使用该药物。而且CIRI 后的细胞损伤主要由于再灌注引起的，并且随之而来的细胞色素C 的释放、caspase -3 的激活、DNA 的破碎最终导致了细胞的凋亡。因此，TPA 的治疗时间窗、禁忌证以及再灌注引起的细胞损伤使其在临床的应用受限。因此本文从CIRI 发生的机制入手，探讨可能的治疗手段。

一、抗氧化剂

脑是机体代谢率最高的器官，且大部分是通过有氧代谢得到能量。正常情况下，活性氧和抗氧化系统之间处于平衡状态。在某种情况下，机体的氧化-抗氧化系统失衡时，机体产生过多的氧化应激产物即活性氧，也被称为氧自由基。自由基是一类包含一个或多个与分子的内部未配对电子的分子。这些自由基与其他分子如DNA 和脂质反应十分活跃，通过与单个电子配对而引起上述物质的氧化。当氧气获得一个额外的电子后，就会形成超氧阴离子，使分子多一个未配对的电子。CIRI 后会产生多种氧自由基及其派生物，主要包括以下两类:(1)属于氧自由基系列，包括超氧阴离子(O-2)，羟基自由基(OH-)等。其主要产生于线粒体中，约2% ～5%的电子流是由其形成的。(2)脂质自由基系列，包括烷自由基、烷氧自由基以及脂质过氧化物自由基等。脑缺血再灌注损伤后，机体活性氧系统和抗氧化系统之间的平衡被打破时会对神经系统产生较为严重的损害作用。在脑缺血早期，脑血管局部血液灌注明显减少，导致缺氧并产生脑损伤。随后的再灌注过程，酶和线粒体将氧作为底物产生大量的氧自由基。多基因脂肪酸脂质过氧化过程中过氧化分解的终末产物如丙二醛(malondiadehyde，MDA)对很多细胞结构，如脂质成分、细胞膜、蛋白成分以及DNA 等产生损伤。

1.天然抗氧化物质:人体存在许多直接的抗氧化物质如自由基代谢酶，包括超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶等，抗氧化剂包括维生素E、维生素C 等。细胞本身也能合成一部分抗氧化剂，如谷胱甘肽等。除了直接作用的抗氧化物质，还包括间接作用的抗氧化剂如金属络合剂，将体内不断生成的自由基清除，维持机体的动态平衡。天然植物中也存在有很多具有抗氧化作用的成分。有人从银杏中提取出一种阿拉伯类型多糖(GBPw)，从多种食物中提出多酚类成分，苦豆子提取物氧化槐定碱等均证明天然植物提取物对脑缺血动物具有抗氧化作用［2～4］。

2.人工合成抗氧化剂:依达拉奉是目前临床上应用较广的脑缺血后静脉用药，也是一种氧自由基清除剂，有报道指出，其可以通过干扰脂质氧化，改善线粒体水肿，提高内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表达，增加脑血流量，减少自由基形成，降低脑梗死面积，防止神经元迟发性损伤［5］。不仅如此，其还有抗凋亡、抗细胞坏死、抗炎作用。临床报道也指出应用该药物治疗脑梗死患者，可以改善脑缺血患者的脑水肿以及预后。因此在日本和中国其应用较为广泛。除此之外，另一种抗氧化的研究也较多。在中枢神经系统，氧自由基可以由很多分子以及结构产生，比如线粒体、黄嘌呤氧化酶、非偶合一氧化氮合酶以及环氧酶等。然而，只有NAPDH 氧化酶是专一的产生ROS 的酶类。与脑缺血有关的NAPDH 氧化酶尤其是第4 类磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶［type 4 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)oxidase，NOX4］，其表达主要分布在神经元［6］。NOX4 敲除的小鼠的脑梗死体积明显减少(75%)，其作用与应用NOX 抑制剂的小鼠相似［7］。因此抑制NOX4 的药物可能为缺血再灌注损伤脑组织提供保护作用。有报道称，酪蛋白激酶2(CK2)是NADPH 氧化酶的重要调节剂，CK2 在脑组织的失活可以通过增加NADPH 氧化酶(第2 类磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，NOX2)的活动，增加ROS 类物质的产生以及神经元的死亡。使用CK2 抑制剂的大鼠脑组织中脑梗死面积明显增加，并且其作用可以被NADPH 氧化酶抑制剂apocynin 削弱［8］。目前NADPH 氧化酶的研究较多，但是不同的亚基表达的部位不同，有些亚基表达在脑组织，并且各个脑区的分布也不太一样。根据目前文献，COX2 是在CIRI 中最为重要的一种。因此COX2 抑制剂有望成为特异性的治疗脑缺血的抗氧化药物。

二、细胞凋亡抑制剂

凋亡被认为是一种程序性死亡，根据目前的研究，主要有3 种引起细胞凋亡的通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路。其中对线粒体通路的研究最为深入和透彻。线粒体是ROS 产生的主要场所，在正常的情况下，它们对机体起防御作用，脑缺血时线粒体易成为ROS 攻击的靶点，导致自由基攻击磷脂膜以及膜电位的变化，干扰其产生ATP 的氧化磷酸化过程。另外，谷氨酸兴奋性中毒、缺血后低氧、Ca2+超载等均会刺激缺血后受损的线粒体ROS 的产生。存在于线粒体内膜上的呼吸链是内源性ROS 的主要来源。目前大多数研究者认为半胱氨酸蛋白酶caspase 家族参与了线粒体相关凋亡的过程。与脑缺血有关的caspase 家族成员有caspase -3、caspase -8、caspase-9、caspase -12 等。另外一个线粒体相关凋亡蛋白家族包括促凋亡蛋白(Bad、Bax、Bim)以及抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl -xl、Bcl -w)。它们通常被认为是通过线粒体内膜的通透性调节细胞凋亡。B淋巴细胞瘤-2 基因(B -cell lymphoma -2，Bcl -2)是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。凋亡诱导因子(apoptosis -inducing factor，AIF)也是线粒体相关蛋白，可以通过细胞核和细胞质两条通路激活凋亡信号［9］。线粒体通路是目前研究较多，也较为透彻的信号路径，也是目前研究的热点。

caspase 抑制剂可能会对凋亡有抑制作用，从而减缓CIRI 损伤。有研究者在大鼠脑缺血-再灌注实验中，证明高压氧预适应能减轻脑损伤和细胞凋亡率，提高细胞色素C(Cyc -C)水平和降低caspase 酶类活性，说明了高压氧预适应对脑缺血-再灌注的保护作用可能与抑制线粒体凋亡通路有关［10］。在目前的动物实验中，凋亡抑制剂途径被认为是值得研究的针对CIRI 的有效方法。有研究者对大鼠进行腹腔caspase-3 抑制剂Z - Asp - Val - Fluoromethyl Ketone(Z-DEVD-FMK)注射，治疗4 天和14 天后观察动物一般生命体征，神经功能评分，脑缺血区域体积，缺血皮质caspase -3 表达以及细胞凋亡的情况。证明caspase -3 抑制剂可以明显改善动物的神经功能评分、梗死体积以及细胞凋亡。根据目前的研究结果，大多数文献支持，海马区CA1、CA2 是CIRI 后容易产生损伤的脑区。就发生时间来说，相对于海马的(48 ～96h)，纹状体在CIRI 后的损伤往往要比海马提前(数小时内)。实际上，很多影响因素包括实验动物、损伤的模型、再灌注的时间等都会影响实验的结果。因此今后的研究需要根据不同的实验目的，选取不同的动物模型，不同损伤区域进行研究。

三、炎症抑制剂

脑缺血后的氧和葡萄糖供应不足，导致了脑缺血区域神经元和炎症细胞的损伤以及代谢产物的集聚。受损的神经元和炎性细胞通过释放炎性因子，如肿瘤细胞因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin -1β，IL -1β)、白细胞介素-6(interleukin -6，IL -6)等，进一步促进黏附分子的表达和炎性因子的募集。最终导致缺血区域血管内皮的渗出和血脑脊液屏障结构的破坏。因此这些炎性因子的抑制剂被认为可以减少脑组织的梗死面积。在众多的炎症相关分子中，NF -κB 是一个重要的调节分子，主要在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞以及炎性细胞中表达。多种NF -κB 抑制剂被认为可以减少炎性因子的表达，从而减少CIRI 后脑组织的损伤［11，12］。另外，Toll 样受体(TLRs)是一种表达在如B 细胞、树突状细胞、小胶质细胞以及血管内皮细胞、星形胶质细胞很多免疫细胞等和神经元等细胞的一种跨膜蛋白。根据其不同作用，大致可以分为4 型。TLRs 的激活被认为和炎症密切相关。TLR2 和TLR4 因其在CIRI 中的重要作用而备受关注，两者可以分泌大量的炎性细胞因子，如IL-23、IL-17、TNF-α 和COX -2 等［13］。因此TLRs 的抑制剂被认为有抗炎作用。但是鉴于炎症在CIRI 中的作用机制较为复杂，尤其是其瀑布级联反应，不是单一的控制某一个反应，或者抑制某一个分子就可以达到控制神经炎症的目的。因此找到有效的控制神经炎症的方法还需要进一步探索和尝试。

四、细胞内外信号通路调节药物

目前研究发现，有很多细胞内外信号调解通路参与了CIRI 的过程。其中之一是ERK 途径，它是细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2，EPK1/2)，也是丝裂原活化蛋白激酶家族的(mitogen - activated proteinkinase，MAPK)一种。激活的MAPKs 通过磷酸化多种转录因子、细胞骨架相关蛋白和其他酶类等多种蛋白底物来调节多种细胞生理过程，参与细胞死亡等生理过程，它也被称为细胞外信号引起细胞核反应的共同通路。脑缺血后，细胞的缺血缺氧通过三级级联反应激活ERK 通路，导致其表达升高。和脑缺血相关的细胞通路抑制剂包括JNK(c -Jun N -terminal kinase)抑制剂、SphK(sphingosine kinase)抑制剂等［14～16］。这些蛋白激酶的抑制剂可以改善CIRI 后脑梗死体积，减轻脑水肿发生，改善神经功能评分。其作用机制或与血脑屏障的修复有关，或与内皮细胞离子通道的开放以及水通道蛋白的表达有关。还有研究表明其作用机制与细胞的凋亡和抑制炎性反应相关，或者是两个或者多个机制共同作用的结果。总之，其具体的机制目前研究不是特别明确，因此其临床应用尚需进一步验证。

五、中药、针刺的抗氧化作用

中医中药在治疗脑缺血再灌注损伤中起到重要作用。中药单方、复方制剂以及针刺疗法等可能通过抗氧自由基，降低MDA 含量，提高SOD 等抗氧化作用产物含量以及自由基反应酶的活性，抑制细胞膜脂质过氧化和自由基的反应性损伤。有研究者探讨黄芪-红花的复合物有效成分黄芪甲苷以及羟基红花黄色素A 对脑缺血的作用。证明其可以增加抗氧化剂如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，同时降低MDA 含量，从而减少ROS 的产生［17］。另外体外实验证明，中药黄芪的提取物黄芪皂甙可以提高缺血缺氧细胞的细胞活性，减少乳酸脱氢酶，氧化应激产物含量，同时减轻细胞凋亡，细胞自噬，线粒体功能的损伤以及内质网应激反应［18］。史慧妍等［19］用醒脑开窍针刺法探讨其对脑缺血大鼠皮质抗氧化蛋白Ⅳ(peroxiredoxin Ⅳ)的表达以及干预作用，结果提示醒脑开窍针刺法与传统针刺手法相比，能够提高大鼠脑缺血后皮质抗氧化蛋白Ⅳ的表达，提高大鼠脑缺血后的抗氧化能力。虽然中医药保护CIRI 取得了一定成就，但是存在中药成分复杂，中药单复方制剂相对较少，辨证论治困难等难题。针灸领域存在针刺手法、取穴、电针参数差异以及针刺对照的选择等问题。

六、其 他

目前针对DNA 损伤，端粒酶是可能的治疗靶点，它是由染色体末端的一系列非编码的重复序列构成，可以防止在细胞分裂过程中编码序列的丢失。体内和体外实验都表明，端粒酶的一个催化亚基端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)可能通过相关机制抑制内源性以及外源性的凋亡通路，减少caspase-3 表达和神经元的凋亡，调整Bcl-2/Bax 比例和线粒体膜动作电位，从而保护受损的神经元［20，21］。虽然端粒酶在脑缺血中可能发挥抗凋亡、减少兴奋性氨基酸的释放、促进神经血管和神经再生等作用，但其作用机制不明确，因此进一步研究有助于通过端粒酶途径改善CIRI。最近的实验结果显示小干扰RNA (siRNAs)和非编码RNA 被认为也具有治疗脑缺血的作用，如caspase -3 的siRNAs 被认为可以减少细胞凋亡，人为沉默一些炎性表达基因也可以减少CIRI 后动物的脑梗死体积［22］。另外，干细胞治疗也在该领域做了一些有益的尝试［23］。

七、展 望

总体来说，针对脑缺血再灌注损伤治疗的药物的研究取得了一定进展。通过抗氧化剂、细胞凋亡抑制剂、炎性抑制剂、干扰细胞信号调节的药物以及中药、针灸等，可以缓解脑缺血再灌注损伤。随着一些先进的实验技术的使用，CIRI 的治疗手段也越来越丰富。但是，鉴于缺血性脑血管疾病十分复杂的发病机制，能够明显减少脑梗死患者致残率、致死率的药物目前仍在探索中，加强治疗脑缺血作用的小干扰RNA 和非编码RNA 以及干细胞治疗等研究工作，寻求一些对脑缺血再灌注损伤治疗明显的药物，将成为今后主要的研究方向。

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