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禽坦布苏病毒分子生物学诊断方法研

2015-12-09于新友李天芝

养禽与禽病防治 2015年8期
关键词:敏感性定量引物

于新友 李天芝 王 艳

(1山东绿都生物科技有限公司 山东滨州 256600 2山东省滨州畜牧兽医研究院 山东滨州 256600)

禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATMUV)可感染鸭、鹅和鸡等多种禽类,引起禽坦布苏病毒病[1](Avian Tembusu virus disease,ATMUVD),该病自2010年在我国暴发以来,迅速波及到全国多个省份[2],给我国养禽业造成了严重的经济损失[3]。禽坦布苏病毒为黄病毒科、黄病毒属成员,引起鸭发病的病毒又称为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)。感染鸭群的发病率高达100%,死亡率在5%~15%,临床表现为高热、蛋鸭产蛋率严重下降、部分感染鸭拉绿色稀便并出现神经症状。病理剖检主要表现为卵巢充血、出血、萎缩和坏死,卵泡破裂,心内膜出血,脾脏肿大。该病造成约1.2亿只蛋鸭和1 500万只肉鸭感染发病,经济损失达数十亿元[4]。本文就近年来禽坦布苏病毒的分子生物学检测方法研究进展作一简要概述,以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

1 核酸探针

核酸探针技术是常用的分子生物学诊断技术,它具有操作简单,不受抗原抗体反应的限制,结果易于判定等优点,适合在基层推广使用。高绪慧等[5]根据GenBank中Bagaza株MDTUV基因组序列设计1对特异性引物,扩增NS3基因406bp的特异性片段,将纯化的PCR产物用地高辛进行探针标记,建立了地高辛标记探针检测MDTUV的方法。该法敏感性高,最低检出限量为100pg/L,特异性好,不与鸭瘟病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和减蛋综合征病毒的核酸发生杂交反应。

2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA为模板进行反转录,再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法,以其简便、迅速及灵敏等优点在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。张帅等[6]建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法,该法具有特异、快速、敏感及准确等特点,可以检出1.82个TCID50的病毒的核酸。李国平[7]根据GenBank上登录的DTMUV基因组序列,设计1对引物,建立了检测DTMUV的RT-PCR诊断方法,该法对Ⅰ型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒和鸭肠炎病毒等常见鸭病的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1ng RNA。张艳芳等[8]根据GenBank中DTMUV E基因和鸭圆环病毒REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100fg,对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为阴性。赵虹等[9]针对GenBank中DTMUV NS2基因、所有亚型AIV M 基因和H9亚型AIVHA基因的保守序列,分别设计了3对特异性引物,建立可同时快速检测DTMUV、所有亚型AIV和H9亚型AIV分型检测的多重PCR检测方法,并对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性,敏感性测定结果显示,该方法能检测到45pg的DTMUV,7.6pg的H9亚型AIV和76pg的AIVM基因。孙敏华等[10]建立了可同时检测DTMUV和EDSV 2种病毒的二重PCR检测方法,特异性试验结果显示,该法可以同时检测DTMUV和EDSV,且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒及大肠杆菌的核酸发生交叉反应,敏感性试验表明,该法对DTMUV的最低检出限为590个拷贝,对EDSV的最低检出限为3 260个拷贝,该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。

3 套式PCR方法

套式PCR,又称巢式PCR。使用2对PCR引物扩增完整的片段,以第一对引物的扩增产物为模板进行第二轮扩增反应,检测的特异性更好,敏感性也更高。颜丕熙等[11]根据DTMUV E基因序列,设计了2对重叠引物P1、P2和P3、P4,建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法,该套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省和上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测,阳性检出率为48/63(76.2%),而病毒分离率仅为13/63(20.6%)。黄欣梅等[12]根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物,建立了禽黄病毒套式RT-PCR检测方法,该法最低病毒检测量为101.89 TCID50/0.1mL,比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。

4 荧光定量RT-PCR方法

实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭反应等优点。Yan等[13]针对DTMUV E基因设计引物,建立了DTMUV TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,该法比常规RT-PCR敏感100倍,最低可检测到50个拷贝的病毒核酸。Yun等[14]针对ATMUV 3′端非编码区设计MGB探针,建立了检测ATMUV的荧光定量RT-PCR方法,检测时间短,2h内即可完成检测。万春和等[15]根据DTMUVNS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBRGreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR,该方法检测DFV NS5基因2.74×103-2.74×107拷贝/μL,反应范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒和番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52%~1.48%,组间变异系数0.71%~2.21%。彭珊等[16]建立了DTMUV的TagMan荧光定量PCR检测方法,该法检测敏感性是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检侧限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好,该法特异性好,对其他鸭病毒核酸扩增结果均为阴性。靳宇田等[17]根据GenBank已发表的DTMUV保守基因序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,建立了检测DTMUV的荧光定量RT-PCR方法,该法特异性好,仅能在DTMUV样本中检出荧光信号,与其他病原不发生交叉反应;敏感性高,质粒最低检测限可达25拷贝/μL。张艳芳等[18]根据GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列,设计合成了2对引物和2条TaqMan探针,建立了同时检测DTMUV和鸭瘟病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该法对DTMUV和鸭瘟病毒的检测灵敏度均达100个模板拷贝数,同时该方法对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为阴性。王楠楠等[19]根据坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,建立了检测坦布苏病毒的SYBRGreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR方法,标准曲线的线性关系显著(r2>0.999),平均试验间变异系数为0.26%,检测敏感性可达到2×101拷贝/μL。曾婷婷等[20]建立了可鉴别坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的二重实时荧光定量RT-PCR方法,该法只扩增这2种病毒的目的片段,无交叉扩增反应,与其他常见禽类病原体也无扩增反应,该检测体系最低可同时检测100个拷贝的坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒,比常规PCR和RT-PCR敏感10~100倍。

5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法是日本学者Notomi等发明的一项恒温核酸扩增技术,具有操作简便、快速、高效、敏感、特异和经济等特点,特别适合在现场和基层应用。Wang等建立的可视化检测ATMUV的RT-LAMP方法在63℃水浴50min内即可完成扩增,敏感性达2拷贝/μL。李兆龙等[21]建立的ATMUV RT-LAMP方法在常规水浴锅中45min内即可完成,灵敏度达1 pg,比常规RT-PCR方法高100倍。RT-LAMP方法本质是一种核酸扩增检测方法,故具有较高的敏感性与特异性,且该方法简便、快速、无需特殊仪器设备,特别适合基层兽医部门使用,具有广阔的应用前景。董嘉文等[22]根据DTMUV E基因保守区域设计了1套引物,建立了检测DTMUV的RT-LAMP方法,该法的最低检测限可达7.8拷贝,其灵敏度是普通RT-PCR的100倍,对其他常见鸭源病毒核酸扩增结果均为阴性。韩凯凯等[23]建立一种基于LAMP技术的鹅源坦布苏病毒检测方法,该法灵敏度极高,是普通PCR方法的100倍,对于其他常见禽RNA病毒均无特异性扩增。欧全宾等[24]根据GenBank发布的坦布苏病毒Bagaza毒株E基因的保守序列设计1套引物,建立了环介导等温扩增快速检测鸭坦布苏病毒的方法。该法的检测敏感性可达10拷贝/μL,对鸭坦布苏病毒山东分离株的检测呈阳性,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、鸭新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和减蛋综合征病毒扩增结果均为阴性。

6 竞争定量PCR方法

竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点,仅探针结合位点不同的内标,在同一反应管内,靶基因和内标物和引物竞争性结合,进行同步扩增。由于竞争作用,当一种模板量逐渐增加时,另一种模板的扩增产物相对逐渐减少,但2种扩增产物的比值和2种初始状态时模板分子数的比值是一致的。根据标准品的准确含量制作标准曲线,从而进行准确核酸定量。袁朋等[25]建立了检测DTMUV的竞争定量PCR方法,该法特异性强、灵敏性高,竞争模板和目标模板可在400个分子/μL的水平上共扩增,能够满足简单快速确定病毒含量的要求。

7 小结与展望

虽然DTMUV分子生物学鉴别诊断方法有较多,但各有利弊,常规RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和检出率高等特点,但不能准确地定量、容易污染,且敏感性有限。荧光定量RT-PCR技术弥补了常规RT-PCR方法的缺点,但是荧光定量PCR仪器和探针的合成价格昂贵,检测成本比较高,这也限制了它的普遍应用。LAMP方法检测快速、简便,适合在基层兽医和养殖场进行推广使用,但LAMP方法灵敏度高易导致假阳性。相信随着分子生物学的发展,不久的将来,一些操作简单、敏感高、特异性好、检测速度快及价格低廉的DTMUV新型分子生物学检测方法将会被建立起来。

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