贵州产杜仲高效液相色谱指纹图谱的建立与分析*

刘星，周欣，周美，陈华国，龚小见

(1.贵阳中医学院中药学系，贵阳 550002；2.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001；3.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵阳 550001)

·药物制剂与药品质量控制·

贵州产杜仲高效液相色谱指纹图谱的建立与分析*

刘星1，2，周欣2，3，周美2，3，陈华国2，3，龚小见2，3

(1.贵阳中医学院中药学系，贵阳 550002；2.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001；3.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵阳 550001)

目的 建立杜仲药材高效液相色谱(HPLC)的指纹图谱，评价不同产地杜仲中化学成分的差异，为制定杜仲的质量控制标准提供参考。方法 色谱柱为Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)，流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液(梯度洗脱)，检测波长235 nm，柱温25 ℃。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行相似度计算，并应用聚类分析与主成分分析对指纹图谱进行化学模式识别法研究。结果 建立了杜仲药材的指纹图谱，确定了19个共有峰，并用对照品指认了3个峰。相似度评价表明，20批不同产地的杜仲药材相似度存在差异；聚类分析将20个样品分成A与B两类。结论 杜仲药材指纹图谱的建立为杜仲的质量控制评价体系提供了科学依据。

杜仲；色谱法，高效液相；聚类分析；指纹图谱

杜仲为杜仲科落叶乔木杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥树皮。杜仲已有2 000多年的入药历史，具有补肝肾、强筋骨、安胎、轻身耐老之功效[1]。《中华人民共和国药典》2010年版一部收载杜仲药材，同时规定了其中松脂醇二葡萄糖苷的含量测定标准[2]。文献记载，杜仲经炮制后指纹峰数与生药材相比有所变化[3-4]。目前，人们多通过高效毛细管电泳法、紫外光谱法、薄层色谱法、高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术和高效液相色谱(HPLC)法对国内不同产地杜仲药材进行指纹图谱研究，但对于道地产区的贵州产杜仲药材的指纹图谱研究不够详细[5-8]，只简单进行了松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸的指认[9]，不能很好评价贵州产杜仲药材的质量。笔者在本实验中采用HPLC法，建立了杜仲药材的特征图谱测试方法，并对贵州20个产地杜仲药材样品进行系统研究和统计学分析，为科学评价杜仲药材的品质提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DIONEX Ultimate 3000(包括四元泵处理器、自动进样器、RS柱温箱、二极管阵列检测器以及 Chromeleon 7.1 色谱工作站)，色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)，KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AL204万分之一电子分析天平和XS-105DU十万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试药 杜仲皮样品见表1。经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为杜仲科植物(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥树皮。绿原酸对照品、京尼平苷酸对照品(均购于中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-201314，111828-201102)、松脂醇二葡萄糖苷对照品(购于贵州迪大生物有限公司，批号：0794-201106)，甲醇为色谱纯(TEDIA COMPANY，INC.，批号：911900)，磷酸[重庆川东化工(集团)有限公司，分析纯]，其余试剂为分析纯，水为实验室自制纯化水。

表1 不同地区的杜仲样品

Tab.1 Eucommia bark samples from different regions

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流动相：甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)；梯度洗脱，洗脱程序为：0～5 min，10%→25%A；～8 min，25%A；～15 min，25%→30% A；～25 min，30%→40% A；～30 min，40%→45% A；～38 min，45%→55% A；～45 min，55%→70% A；～50 min，70%→90% A；～55 min，90%→95% A；～60 min，95% A；检测波长235 nm；流速1 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.2 样品溶液的制备 根据前期研究，确定了本实验最佳的提取工艺[10]，取杜仲粉末1.0 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加入26%乙醇13 mL，称定质量，超声提取25 min，冷却称质量，用26%乙醇补足失去的质量，过滤，取续滤液，过孔径0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 对照品溶液的制备 称取京尼平苷酸对照品6.41 mg、绿原酸对照品3.9 mg、松脂醇二葡萄糖苷对照品4.67 mg、咖啡酸对照品4.66 mg置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，即得。

2.4 样品测定 取各样品溶液和对照品溶液10 μL，分别注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下条件下测定，记录色谱图S1～S20。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验 取编号S2杜仲粉末1份，按照“2.2”项下提取制备供试液，并按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，各共有峰的相对保留时间的RSD均<0.1%，相对峰面积的RSD均<1.5%，精密度良好。

2.5.2 重复性实验 取编号S2杜仲粉末6份，按照“2.2”项下提取制备供试液，并按“2.1”项下色谱条件分别进样，各共有峰的相对保留时间的RSD均<0.1%，相对峰面积的RSD均<2.5%，重复性良好。

2.5.3 稳定性实验 取编号S2杜仲粉末1份，按照“2.2”项下提取制备供试液，并按“2.1”项下色谱条件，分别于0，3，6，12，24，36 h进样，各共有峰的相对保留时间RSD均<0.1%，相对峰面积RSD均<1.9%，稳定性良好。

2.6 杜仲药材指纹图谱的建立与分析

2.6.1 指纹图谱的建立 精密称定杜仲药材粉末1.0 g，按“2.1”项下色谱条件测定，得到20批不同来源的杜仲药材色谱图，20批不同来源杜仲药材指纹图谱色谱峰见图1(R为共有模式)。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”分析，以S2产地样品的色谱图为参照图谱，平均数生成法，选取时间宽度为0.10 min，采用多点校正方式，生成杜仲药材指纹图谱共有模式，得到19个特征峰。通过保留时间对比法，比较对照品与样品中各色谱峰保留时间，指认出3个色谱峰的峰归属，其中1号峰为京尼平苷酸(Rt=8.92 min)；2号峰为绿原酸(Rt=15.81 min)；3号峰为松脂醇二葡萄糖苷(Rt=20.21 min)，样品与对照品的HPLC色谱图见图2。

a.样品；b.对照品；1.京尼平苷酸；2.绿原酸；3.松脂醇二葡萄糖苷

图2 样品(S2)与对照品的镜面图

a.sample；b.reference substance；1.geniposidic acid；2.chlorogenic acid；3.pinoresinol diglucoside

Fig.2 Specular chromatogram of sample(S2) and reference substance

设1号峰为内参比峰，因其峰面积较大，分离度较好。各特征峰在共有模式中的保留时间、峰面积相对于1号峰的相对保留时间和相对峰面积见表2。

2.6.2 相似度分析 对照用指纹图谱和20批样品图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004年A版)，根据20批样品相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点，以相关系数法对样品的相似度进行评价，各样品相似度见表3所示。

从相似度可以看出，整体色谱峰存在差异，不同产地的杜仲与共有模式色谱峰比较，相似度不同，峰面积不等，样品(S5)与共有模式的相似度差异最大，贵州省内的杜仲药材之间的化学成分和成分含量有较大不同。

表2 20批杜仲药材特征峰的相对保留时间及相对峰面积

Tab.2 Relative retention time and relative peak area of characteristic peak for 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv

2.6.3 聚类分析 将20个不同产地的杜仲样品进行聚类分析，利用SPSS 20.0版统计软件，对20个样品所含的共有峰的峰面积作为特征峰，采用离差平方和(Wards’ method)和欧氏距离(Euclidean distance)进行聚类，所得聚类分析树状图，见图3。

表3 20批杜仲药材的相似度

Tab.3 Similarity of 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv.

Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv.

样品被划分为A与B两类。其中，A类进一步进行分类，被划分为A1、A2两类；B类同样进一步分类，被划分为B1、B2两类。阈值=11时，样品可分为五类，第一类包括1，2，6，9号药材；第二类包括11号药材；第三类包括3，5，7，8，12，13，15，18，19号药材；第四类包括10，14，16，17号药材；第五类包括4，20号药材。

2.6.4 主成分分析 将20批不同产地的杜仲样品进行主成分分析，根据20批杜仲样品中HPLC指纹图谱中19个共有峰的峰面积，选取面积较大的主要共有峰作为指标，采用Simca-P 11.50版软件对20批杜仲样品进行主成分分析，以选取的14个共有峰为变量，进行数据标准化处理后，得到杜仲药材主成分分析二维得分图(图4)。

Fig.4 Two-dimensional scoring figure of principal component analysis on 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv

结果显示，样品之间距离越大，相似性越差。由二维得分图可知，20个样品被分为5类，与聚类分析结果一致。

3 讨论

笔者对20批贵州产杜仲药材进行了HPLC指纹图谱数据采集，利用相似度评价软件进行分析，建立了杜仲药材HPLC指纹图谱的共有模式，并得到了杜仲药材指纹图谱的19个特征峰。来源于野生的2号药材，与共有模式比较，其相似度为0.967，表明杜仲HPLC指纹图谱的共有模式可用于整体评价杜仲药材的品质，有利于杜仲药材的规范化种植。

药物指纹图谱色谱峰的峰归属难以确定，所以其具有模糊性的弱点。为了更好评价贵州产杜仲药材的质量，笔者采用保留时间对比法，指认出京尼平苷酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的峰归属，3种化合物的相对峰面积较大，面积之和占所有峰面积的50%以上，同时这3种化合物具有较高的药理活性。这3种化合物的指认与HPLC指纹图谱共有模式相辅相成，为评价贵州杜仲药材的质量控制标准提供了更好的依据。

化学计量学方法运用于中药指纹图谱的数据处理，使得更多的传统中药材、中成药的真伪鉴定、质量评定工作得以实现[11]。笔者应用HPLC法对20个杜仲样品进行指纹图谱的测定，并应用化学计量学方法，进行聚类分析和主成分分析，不同产地的杜仲药材得到了很好的聚类效果，主成分分析的二维得分图与聚类分析得到的结果一致，形成了贵州产杜仲药材化学模式识别的模板，可用于比较与其他产地杜仲药材的差异。从其指纹图谱来看，第一类药材中，2，9号药材中京尼平苷酸较1，6号药材含量多；第二类药材与第一类药材相比京尼平苷酸含量较少，但绿原酸含量较多，与S1相似；第三类药材中，其峰面积大小与指纹峰数差异较小，但各样品中京尼平苷酸含量有差别；第四类药材中差异无统计学意义；第五类药材中，4号药材绿原酸含量较少，其他峰面积大小与指纹峰数差异较小。17，20号药材除峰面积大小有差异，其他差异较小；15，16号药材均采自贵阳市，但指纹峰数与峰面积差异较大。

综上所述，样品虽均产自贵州省，但可能是因为地理位置、气候、日照、生物分布的不同，对样品内在化学物质有一定的影响，即所含化学成分的种类和含量有差别。从方法学考察可知，本实验的精密度、重复性、稳定性良好，有效评价了道地产区贵州少杜仲药材的质量。该方法简便、快捷，可为控制和评价贵州产杜仲药材的整体质量提供参考。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.023

Establishment and Analysis of HPLC FingerprintEucommiaUlmoidesOliv.fromGuizhou

LIU Xing1,2, ZHOU Xin2,3,ZHOU Mei2,3,CHEN Huaguo2,3, GONG Xiaojian2,3

(1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002，China; 2.TheResearchCenterforQualityControlofNaturalMedicine，GuizhouNormalUniversity，Guiyang550001，China; 3.KeyLaboratoryforInformationSystemofMountainousAreasandProtectionofEcologicalEnvironment，Guiyang550001，China)

Objective To establish the high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint ofEucommiaulmoidesOliv.and compare the contents of chemical components ofEucommiaulmoidesOliv.from different habitats,which provides a reference for the development of the quality control standards ofEucommiaulmoidesOliv. Methods The chromatographic separation was performed on a Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm) column with a mixture of methanol-0.05% phosphoric acid (gradient elution) as the mobile phase.The detection wavelength was set at 235 nm, and column temperature was kept at 25 ℃.The similarity was evaluated with the traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation software system.Hierarchical cluster analysis and principal component analysis were applied for the chemical fingerprint pattern recognition. Results The HPLC fingerprint ofEucommiaulmoidesOliv.was set up, 19 common peaks were determined, and three peaks were identified compared to reference substances.The similarity evaluation showed differences among twentyEucommiaulmoidesOliv.samples from different areas, dividing them into classes A and B by the hierarchical cluster analysis. Conclusion The fingerprint ofEucommiaulmoidesOliv.provides evidences for the quality control evaluation of it.

EucommiaulmoidesOliv.; Chromatography,high performance liquid; Hierarchical cluster analysis; Fingerprint

2013-11-25

2014-02-09

*贵州省重大科技专项计划项目(黔科合重大专项字[2012]6009号)；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(黔科合ZY[2011]3013

刘星(1988-)，女，辽宁辽中人，硕士，研究方向：中药质量控制及药物代谢的研究。电话：0851-6700414，E-mail：liuxing13578771405@163.com

周欣(1962-)，女，贵州贵阳人，教授，博士，研究方向：中药和民族药质量控制、中药指纹图谱以及中药新药研究开发。电话：0851-6700494，E-mail：alice9800@sina.com。

R282.71；R927

B

1004-0781(2015)01-0084-05