膜迷路积水动物模型造模方法的研究进展*

陈茜茜，蒋丽元，陈华德

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

梅尼埃病（Meniere’s disease，MD）是以反复发作性、自发性、阵发性眩晕，听力损失，耳闷、耳鸣等为主要临床表现的特发性膜迷路积水综合征。1861年法国医生首次报道了梅尼埃病，Hallpike 等[1]最先提出了梅尼埃病病人的病理改变为膜迷路积水。后来人们逐渐认识到，膜迷路积水是许多内耳疾病相同的病理改变，而MD 仅为其中的一种。鉴于人耳的特殊性，很多实验只能靠建立动物模型来进行，因此，动物模型的制作在梅尼埃病的研究中占据了很重要的地位。本文将目前膜迷路积水动物模型的造模方法及特点等综述如下。

1 手术法

Kimura 等[2]通过手术来阻塞豚鼠内淋巴管和破坏内淋巴囊，首次成功在豚鼠体内复制出了膜迷路积水的动物模型。Konishi[3]在此基础上，创立了后颅窝硬膜外进路法，此法只破坏了部分骨内淋巴囊和淋巴导管，对枕骨破坏小，也减少了对硬脑膜和乙状窦的刺激，存活率也较之前高。Dunnebier[4]探索出了一种不破坏前庭导水管的新方法。具体方法为：模型分为2 组，第1 组分离乙状窦和远端淋巴囊，其间填充明胶海绵；第2 组用硝酸银烧灼附于乙状窦骨外的淋巴囊，不填充任何物质。手术23d 后取材，观察到第1 组大部分豚鼠中度到重度积水，部分轻度积水，最严重的部位在顶转，其次是底转；第2 组部分轻度积水。Dunnebier 认为，内淋巴囊对于淋巴液的吸收是双向的。所以使淋巴囊和乙状窦完全分离是制作MD 模型更好的手术方法，能使我们更好地观察MD 的病理生理学，从而也证明了骨内的淋巴囊在调理膜迷路积水中起着重要的作用。

手术方法制作MD 模型成功率高，但是难度大，操作技术要求严格，动物易感染致死。

2 内分泌调节法

有研究发现MD 患者血清中抗利尿激素（ADH）水平在病情发作时明显高于正常人[5]，说明ADH 在MD 的致病机理中起着一定的作用。Kumagami 等[6]认为，血管加压素（AVP）对膜迷路积水的影响是通过内淋巴囊对内淋巴液的重吸收实现的。其实验方法如下：通过对豚鼠腹腔注射血管加压素，0.5 单位/g·d-1，连续注射60d，制作出了慢性膜迷路积水模型，成功率为70%，其中30%中轻度积水，40%重度积水，并指出：内淋巴囊可能是AVP依赖调节的靶器官，在内淋巴囊中可能存在AVPV2R-cAMP-AQP2 通道，AVP 在内耳通过作用于淋巴囊上皮细胞，减少内淋巴囊对淋巴液重吸收而引起膜迷路积水。

醋酸去氨加压素是ADH 的类似物，邢巍巍等[7]通过腹腔注射醋酸去氨加压素的方法制备豚鼠膜迷路积水模型，4μg/kg·d-1，连续注射1 周。1 周后观察到部分豚鼠有水平性眼震，但时间无特定性，第3周部分豚鼠出现走路蹒跚，ABR 阈值较对照组升高。耳蜗组织切片观察到了40%中度积水，60%重度积水，积水程度从顶转到底转逐步加重，部分前庭膜有破裂，AQP-2 在蜗管外侧壁、螺旋神经节及Corti 氏器等处表达增加。该方法操作简单，模型成功率较腹腔注射血管加压素高，但是在模拟MD 的临床表现方面仍较差。

蒋子栋等[8]在Dunnebier[9]两期法的启发下，发现单纯腹腔注射醛固酮也可以制做出膜迷路积水的模型。具体方法如下：豚鼠腹腔注射醛固酮，0.1mg/kg.d-1，连续注射5d。观察到1 个月后开始出现轻度积水，并随时间变长而加重，从底转开始，2个月之内发展成了中度和重度，ABR 阈值较实验前明显提高。

3 透明质酸凝胶蜗顶注射法

Salt 等[10]通过豚鼠耳蜗顶转注射透明质酸凝胶的方法来诱导膜迷路积水模型，观察到传感位点的持续性变化，Corti’s 器向鼓阶移动，而耳蜗内电位和复合动作电位的变化与Corti’s 器的移位相一致。并推测可能的原因为：在注射过程中，鼓阶底转产生的压力使前庭阶和外淋巴液之间产生了微小的压力差而使凝胶从鼓阶渗透到耳蜗导水管，引起Corti’s 器向鼓阶的移动。该方法诱导的膜迷路积水可以模拟出Corti’s 器持续性向鼓阶凸出的病理改变，耳蜗内部的电位变化也有助于解释MD 患者对外界低频压力改变的敏感性。

4 人工淋巴液注射法

通过向鼓膜直接注射人工淋巴液是诱导膜迷路积水最直接最快速的方法。Kakigi 等[11]观察到，往豚鼠鼓膜内连续注入淋巴液大于3μL 时，外淋巴液中钾离子的浓度明显升高，并认为这是MD 病患者前庭功能障碍的原因之一。Brown 等[12]通过微管在豚鼠内耳蜗中阶缓慢注入人工淋巴液，观察到复合动作电位的阈值升高，基底膜向鼓阶移动；通过向椭圆囊注入人工淋巴液，观察到前庭诱发动作电位的降低，瞬时敏感性增加。而耳蜗内电位变化随着注射速度的快慢具有明显的波动性。这有助于解释MD 患者波动性的病情变化。

5 噪声暴露法

Salt[13]将豚鼠置于200Hz 的低频噪声环境中，给声强度为115dB SPL，3min 后观察到，膜迷路积水约增加30%，并在暴露结束后数分钟恢复，造成了快速的暂时性的听力损伤和膜迷路积水。屈立新等[14]将豚鼠置于4kHz 的窄带噪声环境中，给声强度为120dB SPL，刺激时间为4h，观察到ABR 阈值明显升高后，Caspse-12 蛋白含量在噪声刺激后迅速增高，耳蜗螺旋神经元细胞（SGC）不同程度地凋亡，并指出Caspase-12 活化介导内质网应激参与噪声引起耳蜗SGC 凋亡的过程，能造成模型永久性的听力损失。噪声暴露法能快速建立有效的膜迷路积水动物模型，但该方法诱导产生的积水并不稳定。

6 免疫法

Watanabe 等[15]用KLH 诱导膜迷路积水动物模型，先通过全身KLH 致敏，2 周后再次加强免疫，之后将KLH 注入内淋巴囊行局部免疫，观察到Reissner’s 膜不同程度地凸向前庭阶，检测到了从底转到顶转的一氧化氮合酶（iNOS）免疫反应，并提出假设：iNOS 合酶在膜迷路积水中起着调节作用。通过免疫法诱导膜迷路积水发生率较高，能模拟出MD的病理改变，但造模后模型不稳定，观察周期较长，实验研究较少用。

7 综合法

Segenhout 等[16]利用两期法的原理，先分离豚鼠左耳远端的淋巴囊，之后腹腔注射注射醛固酮，100μg/g·d-1，连续注射5d，成功制备听力损伤的膜迷路积水动物模型。Dunnebier 和Segenhout[17]再一次通过实验验证了此制作方法的优越性。该方法的优点在于，很接近MD 患者波动性的听力变化。手术诱导产生的膜迷路积水主要引起顶转低频听力的下降，醛固酮主要引起底转高频听力的下降，是较为理想的模型。

Kim 等[18]通过腹腔注射醛固酮联合鼓室注入脂多糖（LPS）的方法来诱导膜迷路积水的动物模型。其方法具体如下：腹腔注射醛固酮100μg/100g·d-1，与此同时，通过左耳鼓膜将脂多糖注入到左鼓室，1mg/d，连续注射5d。耳蜗切片结果显示，耳蜗轻度到中度的水肿，在血管纹处压力渗透蛋白94（OSP94）显著提高，但是仍然没有模拟出前庭神经功能紊乱的临床症状。

8 Phex 基因鼠模型

这种模型为PhexHyp 和PhexGy，即位于X 线染色体[19-20]上的具有造成同源性肽酶的磷酸调节功能丧失的基因模型。但是雄性PhexGy 鼠不育，从而失去了其作为研究工具的有用性。Lorenz 等[21]报道了一种新的动物模型，PhexHyp-Duk，该种小鼠会表现出盘旋等前庭功能损害的征象，包括前庭中阶的肿大和听力的损失，并随年龄增长积水程度逐渐加重。Megerian 等[22]指出，该种小鼠在出生后会出现自发性的内耳功能损害，包括盘旋，头上下摇动，步态不稳，该表现在出生后15d 即开始出现，到30d 的时表现已经非常明显。该模型可以作为一个较理想的模型来研究MD，因为它并不需要手术干预。

Ichikawa 等[23]发现，Phex 基因的突变量可能会对矿物离子的代谢产生影响。从而影响其对细胞外磷酸盐浓度的设置点。Semaan 等[24]提出假说，PhexHyp-Duk 鼠产后膜迷路积水进行性恶化的机制可能与内耳螺旋神经元细胞凋亡有关。Wick 等[25]在总结该鼠模型时指出，Phex 基因鼠模型膜迷路积水的发展并不是完全由于基因的缺失，而且该模型内耳螺旋神经元细胞的死亡先于内耳听细胞，所以观察内耳螺旋神经元细胞的凋亡变性，实时性的病理诊断，以及未来神经元的保护治疗可能会成为以后研究MD 的新着手点。

9 总结与展望

综上所述，诱导膜迷路积水的动物模型方法各异，原理也各不同，但都存在自己的局限性，而且造模后对模型的临床表现的观察时间都偏短，虽几经改进，但MD 的临床症状模拟仍未到达很理想的状态。尽管如此，这些造模方法还是对MD 的病因病理以及发病机制的研究带来了很大的促进作用。近几年发展起来的的Phex 鼠膜迷路积水动物模型作为MD 的研究虽较为理想，但是因为基因缺失而带来的对于模型本身其它方面影响仍需要做进一步的研究。

[1] Hallpike CS，Cairns H. Observations on the pathology of Meniere’s syndrome[J]. Laryngol Otol，1938，31（11）：1317-1336.

[2] Kimura RS，Schuknecht HF. Membranous hydrops in the inner ear of the guinea pig after obliteration of the endolymphatic sac[J]. ORL，1965，27（6）：343-354.

[3] Konishi S，Shea J. Experimental endolymphatic hydrops and its relief by interrupting the lateral semicircular duct in guinea pigs[J]. Laryngol Otol，1975，89（6）：577-592.

[4] Dunnebier EA，Segenhout JM，Wit HP，et al. Endolymphatic hydrops after total dissection or cauterization of the distal portion of the endolymphatic sac [J]. ORL，1996，58（5）：271-276.

[5] Takda T，Taguchi D. Aquaporins as potential drug targets for Meniere’s disease and its releated diseases [J]. Handb Exp Pharmacol，2009，190：171-184.

[6] Kumagami H，Loewenheim H，et al. The effect of anti-diuretic hormone on the endolymphatic sac of the inner ear[J].Ptlug Arch，1998，43（6）：970-975.

[7] 邢巍巍，王占伟，刘永新，等. 中耳加压治疗膜迷路积水及其机制的研究[J]. 中国现代医学杂志，2013，23（33）：17-22.

[8] 蒋子栋，张连山. 醛固酮诱发豚鼠双耳膜迷路积水[J]. 中国医学科学院学报，2002，24（5）：501-504.

[9] Dunnebier EA，Segenhout JM，Wit HP. Two -phase endolymphatic hydrops：a new dynamic guinea pig model[J].Acta Oto-Laryngologica，1997，117（1）：13-19.

[10] Salt AN，Brown DJ，Hartsock JJ，et a1. Displacements of the organ of Corti by gel injecfions into the cochlear apex[J]. Hear Res，2009，250（1-2）：63-75.

[11] Kakigi A，Salt AN，Takeda T. Effect of artificial endolymph injection into the cochlear duct on perilymph potassium[J].ORL Otorhinolaryngol Relat Spec，2010，71（1）：16-18.

[12] Brown DJ，Chihara Y，Wang Y. Changes in utricular function during artificial endolymph injections in guinea pigs[J]. Research paper，2013，304：70-76.

[13] Salt AN. Acute endolymphatic hydrops generated by exposure of the ear to nontranmatic low-frequency tones[J].Assoc Res Otolaryngol，2004，5（2）：203-214.

[14] 屈立新，薛英，薛秋红. Caspase-12 在强噪声暴露后豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡中的动态观察[J]. 医学新知杂志，2014，24（1）：39-41.

[15] Watanabe K，Tomiyama S. Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase in the Cochlea following Immune Response in the Endolymphatic Sac of Guinea Pigs[J]. ORL，2001，63（3）：155-159.

[16] Dunnebier EA，Segenhout JM. Sensory Cell Damage in Two-phase Endolymphatic Hydrops：A Morphologic Evaluation of a New Experimental Model by Low-voltage Scanning Techniques [J]. Otology & Neurotology，2001，22（5）：655-661.

[17] Dunnebier EA，Segenhout JM. Cochlear ultrastructure in two-phase endolymphatic hydropsin the guinea-pig[J]. Eur Arch Otorhino laryngol，2002，259（1）：17-23.

[18] Kim CH，Kim YC. Expression of osmotic stress protein 94 in murine endolymphatic hydrops model [J]. Acta Oto-Laryngological，2012，123（10）：118-123.

[19] Francis F. A gene（PEX）with homologies to endopeptidases is mutated in patients with X-linked hypophosphatemic rickets[J]. Nat Genet，1995，11（2）：130-136.

[20] Strom TM. Pex gene deletions in Gy and Hyp mice provide models for X -linked hypophosphatemia [J]. Hum Mol Genet，1997，6（2）：165-171.

[21] Lorenz DB，Guido VE. New intragenic deletions in the Phex gene clarify X-linked hypophosphatemia-related abnormalities in mice[J]. Mamm Genome，2004，15（3）：151-161.

[22] Megerian CA，Semaan MT. A mouse model with postnatal endolymphatic hydrops and hearing loss [J]. HearRes，2008，237（1-2）：90-105.

[23] Ichikawa S，Gray AK. Dosage effect of a Phex mutation in a murine model of X-linked Hypophosphatemia [J]. Calcif Tissue In，2013，93（2）：155-162.

[24] Semaan MT，Zheng QY. Characterization of Neuronal Cell Death in the Spiral Ganglia of a Mouse Model of Endolymphatic Hydrops[J]. Otol Neurotol，2013，34（3）：559-569.

[25] Wick CC，Semaan MT. A Genetic Murine Model of Endolymphatic Hydrops：The Phex Mouse[J]. Curr Otorhinolaryngol Report，2014，2（3）：144-151.