pH和纤维水平对苜蓿纤维吸附铜的影响

刘文，袁雪，王成双，于子涵，曲永利，苗树君，张爱忠，王志博，丁福君

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.鹤岗市东方红乡畜牧站）

pH和纤维水平对苜蓿纤维吸附铜的影响

刘文1，袁雪1，王成双1，于子涵1，曲永利1，苗树君1，张爱忠1，王志博1，丁福君2

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.鹤岗市东方红乡畜牧站）

研究采用体外培养的方法，探究pH和纤维水平对苜蓿纤维吸附铜的影响。研究共分两个试验。试验一：采用2×7析因试验设计，设定两个（3.0和5.5）pH水平及7个铜离子水平；试验二：采用4×7析因试验设计，设定0.125、0.25、0.5和1 g·mL-1的4个纤维水平及7个铜离子水平。体外39℃培养24 h。与pH 3.0相比，pH5.5时的铜离子被纤维吸附的比率更高（P＜0.05）；随着纤维水平的增加，纤维吸附铜离子的比率和吸附量逐渐提高（P＜0.05）。因此得出结论：在pH3.0～5.5条件下，pH越低，苜蓿纤维对铜的吸附性越强；纤维水平越高，纤维对铜的吸附性越强。

苜蓿；吸附；铜；pH；纤维水平

铜是动物不可缺少的微量元素，作为体内多种酶的成分，如细胞色素氧化酶在氧化磷酸化过程中起重要作用，铜也为血红细胞正常形成所必需。此外，铜还是葡萄糖代谢、胆固醇代谢、骨骼矿化作用、免疫功能、红细胞生成和心脏功能等机能代谢所必需的微量元素之一。NRC[1]报道在泌乳奶牛日粮中，硫酸盐形式的无机微量元素铜的利用率仅为5%，奶牛容易发生铜摄入不足的情况。因此，研究影响奶牛对铜的利用效率的因素，有助于提高奶牛对铜的利用效率，以及在奶牛日粮中更加合理的添加铜具有重要指导意义[2，4]。Claye等[1，3]对5种纤维源（小麦麸、稻糠、燕麦纤维、苹果渣和番茄纤维）及它们的不溶成分与铜结合的能力进行了体外研究。研究发现，所有5种纤维中的半纤维素、木质素和纤维素均可结

合铜元素。Sandstead[4]在关于铜的生物利用效率和需要的综述中阐述：铜可与日粮中的半纤维素和木质素形成不易溶解的复合物。Lee[5]研究表明，铜可被斑豆中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维结合。Cummings[6]报道，当人类食物中的纤维水平增加时，粪便中排泄出的微量元素的量升高。Drews[7]也发现，在青少年食物中添加的纤维素和半纤维素可显著增加受试者粪便中的铜浓度，显著降低受试者体内的铜沉积。有研究表明[8]日粮纤维是造成哺乳犊牛和断奶犊牛之间微量元素生物利用效率差异显著的原因，断奶犊牛对铜的生物利用效率明显低于相同年龄的哺乳犊牛。Prevedello等[9]报道，饲喂犊牛纤维含量高的日粮时，小牛血液中锌和铜的浓度降低，这表明小牛饲料中的纤维能够影响铜的生物利用效率。有研究发现，绵羊日粮纤维浓度的线性增加会导致绵羊对锌、铜和锰的表观吸收率线性降低[10]。Camire和Clydesdale[11]研究表明，纤维对金属元素（钙、镁、锌和铁）的结合与pH有关。Thompson和Weber[12]报道，纤维中的内源性的矿物质（铜、锌和铁）在低pH时，与纤维不结合，而当pH上升时，这些矿物质又重新与纤维结合。苜蓿被称为牧草之王，其含有丰富的营养物质，是奶牛的高标准优质饲草，可替代部分精饲料，并能提高乳脂率，增加产奶量。苜蓿中的木质素、纤维素、半纤维素含量丰富，中性洗涤纤维和酸洗洗涤纤维含量高，从理论上来说具有结合微量元素铜的能力。但是，目前国内外关于铜被苜蓿结合情况的研究还未见报告。

虽然目前有机微量元素已经在反刍动物日粮中使用，但是无机微量元素仍是最为常用的日粮中添加的微量元素源。试验通过设定不同的pH和纤维水平，研究无机微量元素被纤维结合的比率及数量，从而探究pH和纤维水平对无机微量元素被纤维结合的规律，为提高奶牛对铜的利用效率，以及在奶牛日粮中更加合理的添加铜具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

试验于2013年3～5月，在黑龙江八一农垦大学动物科技学院反刍动物营养研究室进行。

1.2 苜蓿纤维的制备

将使用的苜蓿粉碎后，过1 mm的筛，取X g粉碎的苜蓿置于一个大小适宜的锥形瓶，并注入Y mL蒸馏水，39℃振荡培养2 h，其中X/Y=5/100，以除去水溶性成分。然后将其水洗，直至水变澄清为止，将过滤残余物在65℃烘干24 h。

1.3 不同pH条件下苜蓿纤维对铜的吸附

试验设置3个重复，在50 mL的离心管中加入预先制备好的苜蓿0.5 g，编号并记录样品重量，分别加入30 mL pH3.0和pH5.5的7个浓度的硫酸铜溶液，摇匀，放置于摇床上，39℃培养24 h，取出，在22℃下1 000 r·min-1离心15 min移取上清液，通过直径为25 mm、孔径45 μm的滤膜过滤，所得液体用于测定铜含量。按照上面步骤准备对照管（不添加纤维）以计算纤维吸附铜的吸附率及量。

1.4 不同纤维水平条件下苜蓿纤维对铜的吸附

试验设置3个重复，在50 mL的离心管中加入0.125、0.25、0.5和1 g的苜蓿，再分别加入pH 5.5的7个浓度的硫酸铜溶液，摇匀，放置于摇床上，39℃培养24 h，取出，在22℃下1 000 r·min-1离心15 min移取上清液，通过直径为25 mm、孔径45 μm的滤膜过滤，所得液体用于测定铜含量。按照上面步骤准备对照管（不添加纤维）以计算纤维吸附铜的吸附率及量。

1.5 铜的测定和苜蓿纤维吸附铜比率及数量的计算

以TAS-990原子吸收分光光度计测定铜含量。配置标准溶液的浓度分别为0、2、4、6、8和10 mg·L-1，每个样品设3个重复，在324.7 nm波长下检测铜含量，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出试验样品的铜浓度。苜蓿纤维吸附铜比率的计算公式如下：

吸附比率=（对照管的铜浓度-培养后的含纤维的培养管中的铜浓度）/对照管的铜浓度。

吸附量=（对照管的铜浓度-培养后的含纤维的培养管中的铜浓度）×溶液体积

1.6 试验设计

试验共分两部分，试验一采用2×7析因试验设计，设定3.0和5.5两个pH水平及15.625、31.25、62.5、125、250、500和1 000 mg·L-17个铜水平；试验二采用4×7析因试验设计，设定0.125、0.25、0.5、1 g·30 mL-1的4个纤维水平及15.625、31.25、62.5、125、250、500和1 000 mg·L-17个铜水平。

1.7 数据处理与统计分析

试验数据用Excel记录并做简单处理，然后采用

SAS 9.12（2003）软件对数据进行一般线性模型（GLM）程序进行两因素重复测量数据的方差分析，并进行Duncan多重比较。同时分析pH和纤维水平影响纤维吸附铜比率及量的直线及二次曲线反应。

2 结果

2.1 pH水平对纤维吸附铜的影响

2.1.1 pH水平对纤维吸附铜比率的影响

图1和表1列出了pH水平对纤维吸附铜比率的结果。从表1可以看出，总体上来说pH3.0条件下的纤维吸附铜比率（平均值67.43%）比pH5.5条件下的纤维吸附铜比率（平均值71.00%）低3.57%（P＜0.01）。从图1可以看出，随着铜浓度水平的增加，不同pH条件下的纤维吸附铜的比率总体上都呈下降趋势（P＜0.01）。从表1也可看出，随着铜浓度水平的提高，纤维吸附铜的比率表现出显著的二次曲线下降趋势（Q，P＜0.001）。

图1 pH水平对纤维吸附铜比率的影响Fig.1Effects of pH on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

表1 pH水平对纤维吸附铜比率的影响Table 1Effects of pH on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

2.1.2 pH水平对纤维吸附铜量的影响

图2 pH水平对纤维吸附铜量的影响Fig.2Effects of pH on absorption amount of copper fiber

图2和表2列出了pH水平对纤维吸附铜量的结果。从图2和表2可以看出，总体上来说pH3.0条件下的纤维吸附铜的量（平均值3.13 g）比pH5.5条件下的纤维吸附铜的量（平均值3.72 g）低0.59 g（P＜0.01）。从图2也可以看出，随着铜浓度水平的增加，不同pH条件下的纤维吸附铜的量总体呈先上升然后下降趋势（P＜0.01）。表2也表明，随铜浓度水平的提高，纤维吸附铜的量表现出显著的二次曲线趋势（Q，P＜0.001）；在500 mg·L-1铜浓度水平时，纤维吸附铜的比率下降。

表2 pH水平对纤维吸附铜量的影响（g）Table 2Effects of pH on adsorption amount of copper fiber（g）

2.2 纤维水平对纤维吸附铜的影响

2.2.1 纤维水平对纤维吸附铜比率的影响

图3和表3列出了纤维水平对纤维吸附铜比率的结果。从图3表3可以看出，随着纤维水平的提高，纤维吸附铜的比率逐渐上升（P＜0.01），随着铜浓度水平的增加，纤维吸附铜的比率总体呈下降趋势（P＜0.01）。从表3也可以看出，随着铜浓度的增加，除1.00 g纤维水平的纤维吸附铜的比率呈线性变化规律外（L，P＜0.001），其它三个纤维水平的纤维吸附铜的比率总体上表现出明显的二次曲线上升趋势（Q，P＜0.001）。

图3 纤维水平对纤维吸附铜比率的影响Fig.3Effects of fiber level on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

表3 纤维水平对纤维吸附铜比率的影响Table 3Effects of fiber level on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

2.2.2 纤维水平对纤维吸附铜量的影响

纤维水平对纤维吸附铜量的结果见图4和表4。从图4和表4可以看出，随着纤维水平的提高，纤维吸附铜的量逐渐上升（P＜0.01），随着铜浓度水平的增加，纤维吸附铜的量总体呈上升趋势（P＜0.01）。从表4也可以看出，随着铜浓度的增加，除0.125 g纤维水平的纤维吸附铜的量呈线性变化规律外（L，P＜0.001），其它三个纤维水平的纤维吸附铜的量表现出明显的二次曲线上升趋势（Q，P＜0.001）。

图4 纤维水平对纤维吸附铜量的影响Fig.4EffectsoffiberlevelonabsorptionamountofCutoalfalfafiber

表4 纤维水平对纤维吸附铜量的影响Table 4Effects of fiber level on absorption amount of Cu to alfalfa fiber

3 讨论

纤维能够通过物理和化学两种方式吸附微量元素。物理吸附主要依靠纤维的物理性状，如疏松的网状结构、较大的比表面积和较大的黏性等，通过范德华力等达到吸附效果；而化学吸附主要依靠纤维化学结构中的活性基团，如羧基、羟基等，通过配位络合及离子交换等作用达到吸附效果。纤维对微量元素离子的吸附与pH有关，pH对物理吸附的影响不大，主要影响化学吸附。pH会影响纤维中活性基团如羧基、羟基等的解离度[13-14]。随着pH的升高，活性基团上的质子解离增多，对微量元素离子的吸附量随之增大，反之pH降低则吸附减少。本研究发现，在pH5.5条件下的铜离子被纤维吸附的比率均比pH3.0条件下的铜离子被纤维吸附的比率高；而在pH3.0条件下的未被吸附（游离）的铜离子量比pH5.5条件下未被吸附（游离）的铜离子的量高。反刍动物瘤胃的pH比其皱胃pH高，因此日粮纤维在瘤胃环境中对微量元素离子的吸附作用要高于皱胃环境。因此可以初步得出在反刍动物瘤胃环境中，纤维对微量元素的吸附比皱胃中要高，在瘤胃中的可利用（游离）的铜离子更少。从表1中125 mg·L-1铜浓度前后吸附率的变化可以看出，前4个铜浓度的吸附率变化不大，而后3个铜浓度的吸附率变化很大，可以看出纤维对铜的吸附存在阈值效应，当铜浓度过大，超过纤维吸附的阈值时，纤维吸附铜的比率会大幅度下降。从表2中铜的吸附量可以看出，500 mg·L-1的铜浓度时的吸附量最大，表明纤维对铜的吸附量有一个饱和度。当纤维吸附铜的量达到饱和度时，继续加大铜浓度水平能使铜的吸附量减小，进而增加可被动物吸收利用的游离铜量，但是过高的铜浓度会对瘤胃微生物和反刍动物有毒害作用。

Kabaija和Smith[10]研究表明，绵羊日粮纤维水平的线性增加会导致绵羊对锌、铜和锰的表观吸收率线性降低。Cummings[6]报道，摄入的纤维越多粪中矿物质排出的越。研究发现，随着纤维水平的增加，纤维吸附铜离子的比率和吸附量逐渐提高，游离铜量逐渐降低。因此，可以看出日粮纤维对微量元素的吸附作用（减少了可利用的微量元素）很可能是反刍动物微量元素生物利用效率低的原因之一，但这一结论仍需进一步的体内验证。从125 mg·L-1的铜浓度水平开始，随着铜浓度水平的提高，不同纤维水平的纤维吸附铜的比率逐渐下降，游离的铜量逐渐增加，可以看出当超过这一铜浓度时，可利用的铜（游离铜）才会明显增加。如果我们要增加反刍动物对铜离子的吸收，可能要在125 mg·L-1铜离子浓度以上，而125 mg·L-1铜离子浓度以下效果不明显。

4 结论

体外培养条件下，培养液pH3.0时的苜蓿纤维对铜的吸附率比培养液pH5.5时的苜蓿纤维对铜的吸附率高，表明pH越低，苜蓿纤维对铜的吸附性越强；体外培养条件下，纤维对铜的吸附率随着纤维水平的增加（0.125、0.25、0.50、1.00）而提高，表明纤维水平越高，苜蓿纤维对铜的吸附性越强。

［1］National Research Council.Nutrient requirements of dairy Cattle［M］.Washington D C：National Academy Press，2001.

［2］陈志宝，张爽，晏磊，等.自然铜的生物转化研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（2）：56-59.

［3］Claye S S，Idouraine A，Weber C W.In vitro mineral binding capacity of five fiber sources and their insoluble components for copper and zinc［J］.Plant Foods Hum Nutr，1996，49（4）：257-269.

［4］Sandstead H H.Copper bioavailability and requirements［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1982，35（4）：809-814.

［5］Lee K，García-López J S.Iron，Zinc，Copper and Magnesium Binding by Cooked Pinto Bean（Phaseohs vulgaris）Neutral and Acid Detergent Fiber［J］.Journal of Food Science，1985，50（3）：651-652.

［6］Cummings J H.Nutritional implications of dietary fiber［J］. The American Journal of Clinical Nutrition，1978，31（10）：S21-S29.

［7］Drews L M，Kies C，Fox H.Effect of dietary fiber on copper，zinc，and magnesium utilization by adolescent boys［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1979，32（9）：1893-1897.

［8］Suttle N.Changes in the availability of dietary copper to young lambs associated with age and weaning［J］.Journal of Agricultural Science，1975，84（2）：255-261.

［9］Prevedello P，Moro L，Brscic M，et al.Trend overtime of total haemoglobin，iron metabolism and trace minerals in veal calves fed high amounts of two different solid feeds［J］. Italian Journal of Animal Science，2010，8（3s）：184-186.

［10］Kabaija E，Smith O.Trace element kinetics in the digestive tract of sheep fed diets with graded levels of dietary fibre［J］.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，1988，59（5）：218-224.［11］Camire A，Clydesdale F.Effect of pH and heat treatment on the binding of calcium，magnesium，zinc，and iron to wheat bran and fractions of dietary fiber［J］.Journal of Food Science，2006，46（2）：548-551.

［12］Thompson S，Weber C.Influence of pH on the binding of copper，zinc and iron in six fiber sources［J］.J Food Sci， 1979，44（3）:752-754.

［13］常秀莲，王文华，冯咏梅.海藻吸附重金属离子的研究［J］.海洋通报，2003，22（2）：39-44.

［14］王忠德，王云翘，宋世廉，等.大豆，大麦种皮中膳食纤维与Fe（Ⅱ），Zn（Ⅱ），Mg（Ⅱ）复合物的红外光谱研究［J］.食品与发酵工业，1994（1）：8-12.

Effects of pH and Fiber Level on Absorption of Copper to Alfafa Fiber in Vitro

Liu Wen1，Yuan Xue1，Wang Chengshuang1，Yu Zihan1，Qu Yongli1，Miao Shujun1，Zhang Aizhong1，Wang Zhibo1，Ding Fujun2
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319; 2.Dongfanghong Township Livestock Station of Hegang）

The objective of the study was to investigate the effects of pH and fiber level on absorption of copper to alfafa fiber in vitro.In experiment 1，the absorption of copper to alfalfa fiber under pH（3.0 or 5.5）was determined with 7 copper concentrations in 2×7 factorial design.In experiment 2，the absorption of copper to alfalfa fiber under 4 fiber level（0.125，0.25，0.5，1 g·mL-1）was determined with 7 copper concentrations in 4×7 factorial design.Comparing with absorption rate of copper to alfalfa fiber under pH 3.0，the absorption rate of copper to alfalfa fiber was higher under pH 5.5（P＜0.05）.With the increased fiber level，the absorption rate or amount of copper to alfalfa fiber increased gradually（P＜0.05）.Under the condition of pH 3.0-5.5，the pH was lower，and the absorption ability of copper to alfalfa fiber was the higher.The level fiber was higher，and the absorption ability of copper was higher.

alfalfa；absorption；copper；fiber level；pH

X53

A

1002-2090（2015）02-0032-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2015.02.008

2014-03-24

国家科技部支撑项目（东北农区奶牛规模化健康养殖生产技术集成和产业化示范：2012BAD12B05-01）；黑龙江八一农垦大学学成、引进人才科研启动计划（XYB2013-13）；垦区奶牛高效精养与营养调控关键技术研究（KNKXIV-08-01-01）。

刘文（1990-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2013级硕士研究生。

王志博，男，讲师，E-mail：andywangdge@163.com。