IGF-1及其受体对小鼠皮肤作用的研究

2015-12-07王恭远刘宁程笳琪赫晓燕山西农业大学动物科技学院

中国畜牧业 2015年2期

关键词：毛囊生长因子日龄

文│王恭远刘宁程笳琪赫晓燕（山西农业大学动物科技学院）

尚淑芬武锋平（山西省忻州市畜牧兽医局）

IGF-1及其受体对小鼠皮肤作用的研究

文│王恭远刘宁程笳琪赫晓燕（山西农业大学动物科技学院）

尚淑芬武锋平（山西省忻州市畜牧兽医局）

动物被毛的生长是一个极其复杂的生理过程，受遗传、环境、营养和代谢水平等诸多因素的影响，遗传是被毛生长发育的决定性因素。小鼠是最常用的试验动物之一，具有多色性、杂食性、适应性差、繁殖力强等特点。

IGF-1也被称作“促生长因子”（somatomedin C），是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。1976年Rinderknecht等将人血浆中的两种不同的类胰岛素生长因子分离纯化出来，并于1978年成功鉴定出它们的化学结构组成和特性。由于它们的化学结构组成与胰岛素原十分相似，所以又将它们命名为“IGF-1（胰岛素样生长因子-1）和IGF-2（胰岛素样生长因子-2）”。目前，有关毛囊周期性变化的调控机理并不十分明确，但已明确一些细胞因子参与了毛发的周期性调控，包括类胰岛素生长因子（IGF）。IGF-1是类胰岛素生长因子家族中的主要成员。研究表明，IGF-1对毛发的生长发育和周期起到一定调控作用。同时还能刺激黑色素细胞、上皮细胞和毛乳头细胞等的增殖分化。

IGF-1与其受体（IGF-1R）结合，通过其受体间的细胞信号途径来刺激毛囊细胞增殖。IGF-1可能通过其受体的细胞信号通路刺激毛囊细胞增殖。有报道称在山羊局部皮肤注射IGF-1能够刺激皮肤蛋白的合成。绵羊皮肤和毛囊中均有IGF-1和IGF-1R的表达，安哥拉山羊和克什米尔绒山羊皮肤也存在大量的IGF-1R。而且IGF-1是许多类型细胞防止其凋亡的存活因子。IGF-1的抗凋亡作用可能是毛囊细胞生长发育的重要因子。并且已有试验说明异黄酮可以通过提高IGF-1的表达，从而促进毛发的生长和皮肤毛囊的形成。还有报道证明羊驼皮肤既是IGF-1作用的靶器官又是内分泌器官。但有关IGF-1及其受体IGF-1R在小鼠不同发育阶段的作用的研究较少。

本试验将以不同发育阶段（3日龄、11日龄、26日龄）的小鼠作为研究对象，利用免疫组织化学方法研究IGF-1及其受体IGF-1R在不同发育阶段小鼠皮肤中的分布，探讨其对小鼠皮肤发育的重要作用，以期为深入研究它们在哺乳动物的皮肤生长和毛囊生长发育中的生物学功能提供理论依据。

一、试验材料

1.试验动物与取材。取3日龄、11日龄、26日龄小鼠的背部皮肤组织，由Bouin氏固定液固定。小鼠由山西农业大学羊驼生物工程试验室培养。

2.主要试验药品试剂与耗材。兔抗IGF-1多克隆抗体、兔抗IGF-1R多克隆抗体、单克隆山羊抗兔二抗SABC试剂盒、DAB显色剂等。

3.试验方法。

（1）石蜡切片的制备。常规方法制片，片厚5微米。

处理载玻片→试验组织修整→脱水、透明→浸蜡→包埋→修块→切片、展片、烤片。

（2）免疫免疫组织化学试验。按照试剂盒说明书进行试验。

切片脱蜡与复水→孵育→磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗→封闭→滴加一抗→PBS缓冲液冲洗→滴加二抗→PBS缓冲液冲洗→滴加SABC→PBS缓冲液冲洗→DAB显色→苏木精复染→脱水、透明→封片。

二、图像采集与数据分析

使用显微镜观察切片，拍照采集图像。每个样本取3张切片，每张切片随机选取5个视野拍照。

使用图像分析软件Image-Pro plus6.0，对不同日龄小鼠皮肤中IGF-1、IGF-1R蛋白的免疫组织化学结果进行光密度值测定，得出阳性细胞光密度值数据。使用SPSS16.0软件进行数据分析统计。

三、试验结果与分析

1.试验结果。IGF-1阳性免疫反应物在3日龄小鼠皮肤中主要分布在表皮的基底层细胞和真皮结缔组织中，呈阳性反应，毛囊阳性表达不明显（图1）；在11日龄小鼠皮肤中毛囊呈阳性反应（图2）；在26日龄小鼠皮肤中的分布十分广泛，各处均可见阳性反应（图3）。

◎图1 IGF-1在3日龄小鼠皮肤中的分布

◎图2 IGF-1在11日龄小鼠皮肤中的分布

◎图3 IGF-1在26日龄小鼠皮肤中的分布

IGF-1R阳性免疫反应物在3日龄小鼠皮肤中主要分布在表皮的基底层细胞和真皮结缔组织中，同时，在毛囊外根鞘部分也有明显分布，以上均呈阳性反应；在11日龄小鼠皮肤中毛囊表达明显，呈强阳性反应；在26日龄小鼠皮肤中的表皮、真皮中均有表达，在毛囊部分弱阳性表达。

2.图像分析及统计结果。分别将IGF-1、IGF-1R免疫反应物在3日龄、11日龄、26日龄小鼠皮肤中的分布情况用图像分析软件进行分析，得到6组试验数据（表1），然后进行统计学处理，结果见图4。

◎图4 阳性表达的平均光密度

表1 阳性表达的平均光密度

四、讨论

通过以上试验表明，IGF-1和IGF-1R随着日龄的增长，其含量先增加后降低，在青壮年时期达到顶峰。有文献报道，IGF-1对肌肉中卫星细胞的增长具有强有效的刺激作用。大量研究表明，IGF-1可抑制细胞凋亡，维持细胞存活。人、鼠、山羊、绵羊等的皮肤和毛囊中有丰富的GH-R、IGF-1和IGF-1R基因表达，IGF-1对毛生长调控起重要作用。因此，IGF-1和IGF-1R伴随着小鼠日龄的增大其含量在皮肤中的表达应呈现变化趋势。通过试验发现，在3日龄小鼠皮肤中毛囊数量较少；在11日龄小鼠皮肤中毛囊数量很多，毛囊生长致密，此时小鼠被毛发育较3日龄时相比已经发生了很大的变化，11日龄小鼠被毛程度较高，在26日龄时被毛发育处在生长静止期，开始退化，毛囊稀少。IGF-1和IGF-1R在3日龄小鼠皮肤中表达较少，在11日龄小鼠皮肤中表达较高，在26日龄时萎缩部位弱阳性表达。以上分析表明，在3～11日龄期间，小鼠毛囊处在生长初期到生长旺盛期，IGF-1、IGF-1R的含量也在不断提高，到了26日龄时，小鼠毛囊处在生长静止期，毛囊出现数量减少、退化的现象，IGF-1、IGF-1R的含量也开始降低。这种变化与小鼠的生长周期一致，即伴随着被毛及个体的发育，IGF-1、IGF-1R的含量也在不断提高，作用也越来越显著，当到达一定时期后，被毛出现生长静止期，IGF-1、IGF-1R含量也开始降低，作用也越来越弱。