烟草叶际细胞分裂素产生菌Y-P22的筛选、鉴定及其应用效果

邵兰军,刘凯,李宙文,张忠民,赵文婷,姚良同,杜秉海,丁延芹*

1.广东中烟工业有限责任公司,广东广州510000

2.山东农业大学生命科学学院/山东省农业微生物重点实验室,山东泰安271018

3.济宁学院,山东济宁273155

烟草叶际细胞分裂素产生菌Y-P22的筛选、鉴定及其应用效果

邵兰军1,刘凯2,李宙文1,张忠民3,赵文婷2,姚良同2,杜秉海2,丁延芹2*

1.广东中烟工业有限责任公司,广东广州510000

2.山东农业大学生命科学学院/山东省农业微生物重点实验室,山东泰安271018

3.济宁学院,山东济宁273155

通过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析将Y-P22鉴定为缺陷短波单孢菌（Brevundimonas diminuta）。该菌株是从烟草叶际分离的，具有较强的细胞分裂素产生能力。田间应用效果表明，该菌株能有效促进烟叶开片，提高烟叶的可利用性；感官评吸质量结果表明该菌株可以明显提升烟叶内在质量。

烟草;叶际;细胞分裂素;缺陷短波单胞菌

随着我国卷烟工业迅速发展，作为卷烟工业最重要原材料的烟叶已成为各大企业争先抢夺的战略物资，如何提高烟叶质量和产量更是各大企业关注的重点。提高烟叶质量的常规方法通常有两个途径：一是在烟草生长过程中通过合理施肥、尤其是叶面钾肥的使用来提高烟叶产量和质量；二是在烟草加工过程中，利用物化手段适当处理来降低烟叶中的烟碱含量，从而提高烟叶的可利用性。近年来，微生物资源在烟草生产的各个领域的应用成为众多科研工作者的研究热点。研究发现应用微生物及其制剂不仅可以降低烟碱含量，还可以增加烟叶的香气，改善烟叶品质[1,2]。较之以前方法具有无需特殊处理，没有残留，不会污染环境的优点。目前研究较多的可以用于烟草种植和加工的细菌种类主要有烟草节杆菌（Arthrobacter nicotianae)、嗜烟碱节杆菌(A.nicotinovorans)、氧化节杆菌(A.oxidans)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas puida)、芽孢杆菌（Bacillus spp.）等[3-6]。本研究对从烟草叶际分离的1株能促进烟叶开片，改善上部烟叶质量的菌株Y-P22进行鉴定，并对其应用效果进行研究，发现该菌可以明显改善烟叶的内在质量，在生产中具有巨大的应用潜力和价值。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验菌株Y-P22为本实验室从烟草叶际分离，能够产生细胞分裂素。

1.1.2烟草品种K326。

1.1.3培养基0.5%烟叶，3%豆芽，1000 mL H2O。

1.2实验地点

1.2.1室内实验在山东农业大学微生物学系植物根际促生细菌研究室完成。

1.2.2田间实验在遵义县科技示范园完成，土壤类型为黄壤，中等肥力。

1.2.3感官质量烟叶评吸由黄果树集团公司技术中心原料所完成。

1.3实验方法

1.3.1Y-P22的鉴定形态特征和生理生化特征测定方法参阅文献[7]。

1.3.2DNA提取和16S rDNA序列扩增DNA的提取参考文献[7]。

引物为P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’和P2：

5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，由上海英俊生物技术有限公司合成。

PCR反应体系（25 μL）为：Taq 0.5µL,10×Buffer(Mg2+)2.5µL,dNTP(10 mM each)0.5µL,引物1µL,模板1µL,depc水19.5µL。

PCR反应条件为:95℃5 min,94℃1 min,56℃1 min,72℃1.5 min 30个循环,72℃延伸10 min。

用3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒（3S Spin Agarose Gel DNA purification kit）纯化PCR产物。

1.3.316S rDNA序列测定及分析PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成。测序结果用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析。

1.3.4菌液制备用液体培养基接种新鲜菌种，摇床振荡培养过夜，充分摇匀，用清水稀释200倍备用。

1.3.5田间实验在上部烟叶采摘前1月左右，将上述菌液喷施于烟草中上部叶片（以叶片背面为主）；间隔7 d后，进行第二次喷施，共2次。以傍晚喷施为宜，忌雨天喷施。以等量的清水和处理方式做为对照。处理45 d后，按照中华人民共和国烟草行业标准烟草农艺性状调查方法调查烟叶的长势，叶片颜色和叶面积。各种栽培管理措施按当地高产优质烤烟栽培技术精心管理。

1.3.6烟叶感官质量评吸评吸指标主要考核香气特征的香气质和香气量，烟气特征的浓度和劲头，吃味特征的杂气、刺激性和余味，以及物理特征的燃烧性和灰色等。具体按照行业内部标准执行，由黄果树集团公司技术中心原料所给出结论。

2　结果与分析

2.1Y-P22形态特征

Y-P22菌落较小，圆形，边缘整齐，湿润，半透明，呈灰白色（图1 A）。菌体细小杆状，革兰氏染色阴性，该菌在培养初期和培养后期形态上有明显变化。菌体大小为0.25～0.5×0.75～1 μm，不产芽孢，储存的菌种染色后着色很浅，模糊不清（图1 B），培养24 h后染色深而清晰，菌体呈短杆状（图1 C）。

图1　P22形态特征A菌落形态；B、C菌体的倒置摄像显微照片（×1000）Fig.1 Shape of bacterial strain Y-P22A Colony;B＆C Photos of cell(×1000)

2.2生理生化特征

该菌不能利用葡萄糖和乳糖产酸产气，接触酶阳性，不产生吲哚，不能液化明胶，苯丙氨酸脱氨酶阴性。与Brevundimonas diminuta模式菌株的生理生化特征相符。

2.316S rDNA的特异性扩增和序列分析

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图2。

图2　PCR产物电泳图M为2 kb ladder；泳道1为PCR产物Fig.2 Electrophoresis map of PCR productsM is 2 kb ladder；Lane 1 is PCR products

以总DNA为模板扩增出大约1.5 kb大小的片段（图2），纯化后送公司测序。结果表明此片段大小为1338 bp，通过用BLAST比对，与Brevundimonas diminuta 2P02AA的16S rDNA序列（EU977662）相似性为99%。序列提交GenBank，收录号为EU240971。

通过其形态学特征，生理生化特征和16S rDNA的序列分析初步将Y-P22鉴定为缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）。

2.4田间实验结果

田间调查结果见表1。

表1　烟草生长情况调查表Table 1 Investigation on the growth of tobacco

从表1可以看出，由菌液处理的烟株其田间长势较好，与对照处理相比，烟株的叶面积增加，并且处理后的烟株上二棚叶片的叶面积增加较为明显，达到58.8%，而烟株顶叶叶面积增加约40%，从试验的结果来看，菌液的使用有利于改善上部烟叶开张程度、改进烟叶品质，更有利于提高烟叶的可利用性。

2.5烟叶感官质量评吸

处理烟叶达到工艺成熟时进行采收，采用三段式烘烤工艺烘烤。送黄果树集团公司技术中心原料所评吸，结果如表2所示。

表2　烟叶感官质量评吸结果Table 2 The sensory evaluation on tobacco

结果表明使用菌液的烟叶内在质量有较大提升，烟气协调性较好，香气有提升，甜度增加，口感改善具有一定的作用。同时，可降低劲头，减少杂气、刺激，说明菌液的作用效果显著。

3　讨论

本文所讨论的菌种Y-P22分离自烟草叶际，以烟草浸出汁为培养基生长良好，它比其它来源的微生物菌种更有利于定殖于烟草叶片；实验结果表明该菌株能同时提高烟草质量和产量。一方面，它可以产生细胞分裂素，在栽培期间喷施于叶片，可以有效的增加烟叶叶片面积，最高增加58.8%，大大提高了烟叶产量；另一方面，实验烟叶的感官质量评吸结果较好，它提升了烟叶的内在质量，同时，可降低劲头，减少杂气、刺激。菌种Y-P22（Brevunmdimonas diminuta）原属于假单胞菌属，1994年Segers将其另立新属－短波单胞菌属（Brevunmdimonas）[7]。关于假单胞菌可产生香味物质，降低烟碱含量[8-10]早有报道，我们的实验验证了这一结论。但是微生物的使用同时提高烟叶产量，提升烟叶质量，属于首次报道。利用微生物处理烟叶，可以降低烟碱含量，增加烟叶香气，改善烟叶品质，提高烟叶质量等级，缩短发酵时间等优势[11-14]；还可以减少化肥施用带来的土壤板结和环境污染问题。从自然界筛选高效菌种资源，对于优质烟叶的生产具有深远的意义，微生物在烟草行业中的应用具有重大经济价值和社会价值。

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Screening,Identification and Application of the Strain Y-P22Producing Cytokinins in Phyllosphere of Tobacco

SHAO Lan-jun1,LIU Kai2,LI Zhou-wen1,ZHANG Zhong-min3,ZHAO Wen-ting2, YAO Liang-tong2,DU Bing-hai2,DING Yan-qin2*
1.China Tobacco Guangdong Industry Co.Ltd.,Guangzhou 510000,China
2.CollegeofLifeSciences,ShandongAgriculturalUniversity/ShandongKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,Taian271018,China
3.Jining University,Jining 273155,China

The Y-P22 was identified as Brevundimonas diminuta based on morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence.The strain was isolated from the tobacco phyllosphere.It can produce cytokinin.The results of field experiment and tobacco sensory evaluation showed that the strain could effectively improve the availability of tobacco and the quality of tobacco.

Tobacco;phyllosphere;cytokinin;Brevundimonas diminuta

TS41+4

A

1000-2324(2015)02-0194-04

2013-05-20

2013-06-02

广东中烟工业有限责任公司资助项目(粤烟工15XM-QK[2011]-001)

邵兰军(1984-),男,湖北荆州人,硕士,农艺师,主要从事烟叶基地单元技术指导工作.

Author for correspondence.E-mail:dingyq6885@163.com