象皮生肌膏对2型糖尿病大鼠溃疡肉芽组织转化生长因子－β及纤维结合蛋白表达影响的实验研究

张月娟，李木清，刘 梨，王小亮

糖尿病主要以血糖增高为主要临床表现，病人往往伴有多尿、多饮、多食、消瘦等临床症状。由于糖尿病病人伴有严重的并发症，如糖尿病足部溃疡，其发病率约为15%，而其中截肢者高达33%，因糖尿病足死亡率为29%［1］。故如何有效治疗糖尿病足溃疡显得尤为重要。本实验通过对2型糖尿病大鼠溃疡采用象皮生肌膏治疗，观察新生肉芽组织转化生长因子－β（TGF－β）、纤维结合蛋白（FN）分子生物的表达及创面愈合率的变化。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 SD成年健康清洁级大鼠，雄性，体重（260．56±19．34）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物许可证号：SCXK湘2011—0003。

1．1．2 试剂 大鼠TGF－β及FN的ELISA检测试剂盒来自北京杰辉博高生物科技有限公司。

1．1．3 一般材料 10%水合氯醛（上海盛利泰化有限公司），生理盐水，水胶体敷料［康乐保（中国）有限公司康惠尔溃疡贴，批号：2640124］，青霉素（华北制药股份有限公司，批号：F3082108），一次性使用无菌注射器（武汉帝王冠医疗器械有限责任公司）；象皮生肌膏（湖南中医药大学附一院药剂科自制，批号：20120918）及其他相关材料。

1．1．4 仪器 美国生产AllegraX－15R台式冷冻离心机，上海精密科学仪器有限公司生产JY3002型电子天平，德国LEICA公司产DM LB2型双目显微镜，北航公司产 MIAS医学图像分析系统，英国生产的Shandon325型石蜡切片机，麦克奥迪实业集团公司生产的Motic B5显微摄像系统及其他相关仪器。

1．2 方法

1．2．1 造模 ①选取180只SD健康成年雄性清洁级大鼠，适应性喂养1周。然后随机选取45只大鼠为空白对照组，喂养同前；其余135只予高脂高糖饲料喂养6周，然后从大鼠尾静脉采血，测量大鼠C肽及血糖，判断动物出现胰岛素抵抗后，再予尾静脉注射1%链脲佐菌素（STZ）30mg／kg，1周后测血糖≥16．7 mmol／L，则认为糖尿病造模成功［2］，成功造糖尿病模型134只。②糖尿病成功造模后，当天对134只糖尿病大鼠制备溃疡模型［2］，术前每只大鼠肌肉注射8U～10U的青霉素预防感染，然后用亚甲蓝在大鼠背部作一直径17mm圆形标记，最后对大鼠背部脱毛；用碘酒和乙醇对大鼠背部圆形标记脱毛区消毒，采用打孔器，在大鼠脱毛消毒区打孔，溃疡直达筋膜，然后进行清创、止血、包扎；术后以能自由饮水、摄食者为溃疡模型，成功造溃疡模型130只。

1．2．2 动物分组方法 从空白对照组45只SD雄性大鼠中按照随机数字表法完全随机抽取40只大鼠。溃疡模型130只大鼠按照血糖、体重分层随机分为模型组、阳性对照组和实验组，每组选取40只。

1．2．3 治疗方法 4组大鼠单笼喂养，换药前均先用无菌棉签蘸取无菌生理盐水进行清创，再以1%碘伏消毒，最后以无菌棉签对大鼠局部干燥。模型组予生理盐水纱布外敷，阳性对照组予水胶体敷料外敷，实验组予象皮生肌膏外敷。3组每天均换药1次，肉眼观察创面症状的变化及愈合情况。

1．2．4 疗效评价方法

1．2．4．1 创面肉眼及组织学观察 肉眼观察创面愈合情况；显微镜下进行组织学观察。

1．2．4．2 创面TGF－β及FN表达检测 分别于治疗后的第1天、第7天、第14天、第21天从每组随机选取10只大鼠处死并取相同部位创缘组织，经4%多聚甲醛固定，石蜡切片，采用免疫组化检测TGF－β及FN的表达，比较4组创面第1天、第7天、第14天、第21天免疫组化检测TGF－β和FN阳性表达；在400倍镜下观察4组创面第1天、第7天、第14天、第21天免疫组化检测TGF－β和FN阳性表达的分布。

1．2．4．3 溃疡愈合率的计算 分别在治疗后的第1天、第7天、第14天、第21天用数码相机对大鼠创面照相，采用图像分析IPP软件计算未愈合面积、创面愈合率。创面愈合率＝（原始创面面积－未愈合创面面积）／原始创面面积×100%。

1．2．5 统计学分析 采用SPSS17．0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验；计数资料用χ2检验，以百分比表示。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 创面溃疡组织肉眼及组织学观察 ①空白对照组：组织学无明显变化。②模型组：大鼠术后创面较干燥，色泽暗淡，肉眼生长缓慢。肉眼观察大鼠术后创面第10天开始愈合，绝大多数大鼠到第21天创面也未完全愈合。组织学观察TGF－β表达在第7天达峰值，而后逐渐下降；FN表达一直呈上升趋势。③阳性对照组：大鼠术后创面较湿润，肉芽组织生长较缓，其色较鲜艳。肉眼观察术后大鼠创面第6天开始愈合，在第21天基本愈合。组织学观察TGF－β表达在第7天达峰值，而后一直下降；FN表达一直呈上升趋势。④实验组：大鼠术后创面伴渗出液，肉芽组织生长较快，呈淡红色。肉眼观察术后大鼠创面在第3天少量大鼠开始愈合，在第16天绝大多数大鼠基本愈合，在第21天所有大鼠完全愈合。组织学观察TGF－β表达在第7天达峰值，而后一直下降；FN表达在第14天达峰值，而后FN含量开始下降。见封三图1、图2。

2．2 4组TGF－β表达的动态比较 实验组在第1天、第7天、第14天、第21天TGF－β阳性表达都高于阳性对照组TGF－β阳性表达（P＜0．05），也高于模型组TGF－β阳性表达（P＜0．05）；阳性对照组第1天、第7天、第14天、第21天TGF－β阳性表达均高于模型组TGF－β阳性表达（P＜0．05）。见表1。

表1 4组TGF－β表达变化比较（±s）

表1 4组TGF－β表达变化比较（±s）

组别 只数 第1天 第7天 第14天 第21天4±14．21模型组 10 76．52±13．65 89．51±14．33 76．39±13．55 58．50±10．04阳性对照组 10 124．33±15．98 202．41±16．94 175．90±15．88 136．46±14．82实验组 10 154．61±16．051） 251．32±17．021） 206．43±16．091） 158．84±15．471）1）与其他3组同时间点比较，P＜0．05。空白对照组 10 95．88±15．47 94．37±17．42 95．34±16．42 95．3

2．3 4组FN表达的动态比较（见表2）

表2 4组FN表达动态变化比较（±s）

表2 4组FN表达动态变化比较（±s）

组别 只数 第1天 第7天 第14天 第21天00．83±10．51模型组 10 63．21±8．94 95．61±8．73 187．41±12．07 236．42±14．45阳性对照组 10 101．30±10．48 227．00±16．45 298．71±17．06 359．63±17．85实验组 10 132．00±13．051） 285．00±16．931） 454．33±19．631） 283．60±15．441）1）与另外3组同时间点比较，P＜0．05。空白对照组 10 100．62±10．47 100．30±10．74 100．80±10．63 1

2．4 3组愈合率及愈合时间动态比较（见表3）

表3 3组溃疡创面愈合率动态比较（±s） %

表3 3组溃疡创面愈合率动态比较（±s） %

组别 只数 第1天 第7天 第14天 第21天36阳性对照组 10 6．52±1．47 33．06±3．63 65．73±5．41 86．35±5．30实验组 10 10．80±2．141） 44．92±3．741） 86．78±5．011） 100．001）1）与其他两组同时间点比较，P＜0．05。模型组 10 2．33±0．53 22．71±3．98 49．09±4．26 75．04±5．

3 讨论

目前2型糖尿病病因尚不十分清楚，其主要病理机制为胰岛素分泌相对不足或胰岛素抵抗，临床主要表现为血糖高于正常范围。高血糖导致糖代谢、脂代谢、蛋白代谢等发生异常，累及心、脑、肾、眼、神经等重要脏器；特别是对糖尿病足部溃疡，其致残率高，严重影响病人的日常生活［3］。在传统中医学中，糖尿病属“消渴”范畴，糖尿病足属“脱疽”范畴，多因劳倦、情志所伤或久病等导致的气阴两虚，不能正常行血和濡养脏腑组织，致使脉络损伤，而发为血瘀；久则化热，而败坏肌肤筋骨等，演变为脱疽。其病性属本虚标实。根据中医急则治标的原则，应快速治愈足部溃疡，防止严重的并发症。故本实验通过对大鼠2型糖尿病足部溃疡成功造模，然后通过免疫组化法检测TGF－β，FN的分子生物表达及创面愈合率来评价创面愈合效果，对临床治疗糖尿病足具有实际指导意义。

本研究结果显示：4组TGF－β的表达在第7天均达峰值，而后一直降低；4组FN的表达只有实验组最先在第14天达峰值，其余3组一直处于上升趋势。实验组中大鼠在任意时间段TGF－β表达、FN表达及创面愈合率与其他3组间均存在差异（P＜0．05）。说明2型糖尿病溃疡大鼠损伤组织中TGF－β，FN在不同时间段都存在表达，但是实验组TGF－β表达最多、FN能提前表达且含量最多，故象皮生肌膏对于2型糖尿病大鼠溃疡，能快速促进肉芽组织TGF－β及FN的表达，促进伤口愈合。

TGF－β是一类具有多功能的细胞因子，能对细胞周期进行调控，从而影响细胞分裂［4］；能诱导新生肉芽组织生成，加速组织的修复［5］。FN是一种具有广泛生物学特性的糖蛋白，广泛存在于细胞表面、体液及结缔组织中，具有防御功能和维持机体完整性的物质；能在创面形成富含FN的基层胶原纤维－纤维蛋白复合物，并进行增殖，直至上皮化愈合，在伤口修复愈合中起重要作用［6］。所以，损伤组织中TGF－β及FN的表达能间接反映创面愈合情况。而象皮生肌膏为中成药制剂，其主要中药成分为血余碳、生地黄、龟甲、当归、石膏、炉甘石、蜂蜡及象皮。血余碳能活血化瘀、收敛止血，现代研究表明血余碳具有明显的凝血、抗血栓及抗菌作用［7］；生地黄、龟甲、当归能补气养血，起扶正固本之作用；石膏、炉甘石能清热解毒并凉血生肌，具有抗感染作用；蜂蜡及象皮养阴并保持局部组织湿润，促进创面愈合［8，9］。诸药合用，共奏养血活血、止痛敛疮，同时解毒生肌。正如本实验应用象皮生肌膏大鼠FN在第14天表达就达高峰、TGF－β在第7天表达达高峰且含量与其余3组比较差异具有统计学意义（P＜0．05），说明象皮生肌膏能促进FN及TGF－β在溃疡部位的表达。故应用象皮生肌膏大鼠创面愈合时间最早、愈合率最高。可见，对于糖尿病溃疡，在现代药物治疗的基础上，应发挥传统中医特色，使之为人类健康服务。

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