临床酵母样真菌的系统鉴定及耐药性研究

王洪曼 孙铭艳 王保强 陶元勇*

[文章编号] 1672-8270(2015)03-0067-04 [中图分类号] R446.5 [文献标识码] A

临床酵母样真菌的系统鉴定及耐药性研究

王洪曼①孙铭艳②王保强②陶元勇②*

[文章编号] 1672-8270(2015)03-0067-04 [中图分类号] R446.5 [文献标识码] A

目的：通过对酵母样真菌的系统鉴定，分析医院酵母样真菌感染情况及耐药现状，以指导临床合理用药，为减少真菌感染提供试验依据。方法：将各种临床标本分离培养后使用法国VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪、酵母菌鉴定卡及ATB Fungus 3药敏板进行真菌鉴定和药敏试验。结果：共检出院内酵母样真菌感染210例，以假丝酵母菌为主(占97.14%)，其中白色假丝酵母菌140株(占66.67%)，热带假丝酵母菌30株(占14.29%)。对伊曲康唑的敏感率最低仅为53.3%，对氟康唑、伏立康唑、卡泊芬净、5-氟胞嘧啶和米卡芬净的耐药率均＜7%，两性霉素B耐药率为0%。结论：假丝酵母菌是院内感染最常见的酵母样真菌，耐药性有增长趋势，故应加强真菌的分离、鉴定以及耐药性监测，以指导临床合理选择药物。

酵母样真菌；系统鉴定；耐药性；阿萨希毛孢子菌

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.03.022

[First-author’s address] Department of Laboratory Medicine, Weifang Medicine University, Weifang 261053, China.

真菌在自然界分布极为广泛，且种类繁多，并寄生于人体皮肤和黏膜，属于条件致病菌。近年来，由于广谱抗生素、抗肿瘤药物、激素和免疫抑制剂在临床的广泛应用，器官移植及导管技术的开展以及艾滋病和糖尿病发病率的不断上升，真菌感染的发病率呈上升趋势[1]。目前，临床上可用于抗真菌的药物有限，而耐药率也逐渐升高，并且出现二重感染。因此，加强真菌感染的控制及药物监测，有效防治真菌二重感染及提高治愈率已成为目前临床医学领域中的一个重要课题。本研究收集临床标本中分离到的真菌210株，对其临床分布及耐药情况进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集潍坊医学院附属医院于2013年1-12月住院的患有慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、支气管扩张及肺癌等肺部基础病以及尿路感染、真菌性阴道炎及骨髓炎等患者标本和门诊送检的各类标本。入选患者1680例，其中男性875例，女性805例；年龄1～90岁，从中分离出酵母样真菌210菌株，剔除相同部位的重复菌株。

1.2 设备与材料

(1)仪器与试剂。采用法国生物梅里埃公司生产的VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪、Bact/ ALERT 3D 120全自动血培养仪；使用哥伦比亚血琼脂平板、沙保弱培养基、VITEK 2酵母菌鉴定卡YBC；酵母样真菌药敏试剂盒(微量稀释法)ATB Fungus 3为法国梅里埃Biomerieux公司产品；卡泊芬净、米卡芬净等微量肉汤稀释法药敏试验检测板条由山东鑫科生物科技股份有限公司提供。

(2)培养基。使用改良SHADOMY琼脂，适用于所有的抗真菌药，主要成分包括酵母氮琼脂基础，葡萄糖和天冬氨酸，通过磷酸缓冲液控制二重感染，pH值为7.0。同时添加氯霉素控制细菌的污染。

(3)标准菌株质量控制。本研究所用白色念珠菌ATCC90028、近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258均由卫生部临床检验中心提供。

1.3 方法

(1)分离培养与鉴定。血液、腹水等无菌体液标本操作接种于培养瓶内，经Bact/ALERT 3D 120全自动血培养进行培养，阳性报警后涂片观察并转接种于沙保弱培养基上。痰液、尿液及分泌物等直接接种于沙保罗培养基、血平板上，放入35℃孵育箱培养18～24 h，通过菌落观察和涂片进行初步鉴定。挑取培养基上单个酵母样菌落，采用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和酵母菌鉴定卡YBC对真菌种类作出鉴定。

(2)药敏。利用酵母样真菌药敏试剂盒(微量稀释法)ATB Fungus 3酵母样真菌药敏板条对210株菌株进行药敏试验，药敏结果可通过肉眼判读，或者应用ATB仪器判读获取MIC，按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准和ATB Fungus 3产品说明书的建议将菌株分为敏感、中介或耐药。

(3)数据处理与分析。药敏试验结果应用WHONET 5.6专业软件进行数据处理和分析。

2 结果

2.1 临床标本来源及分布

酵母样真菌感染患者的年龄分布在1～90岁，其中男性60例(占57.1%)，女性45例(占42.9%)；60岁以上的老年患者61例(占58.1%)。所分离出的210株酵母样真菌分布在临床各类标本中，其中主要来自痰液(占27.62%)、尿液(占16.19%)、咽拭子(占12.36%)、分泌物(占12.36%)和脓液(占10.48%)等标本，分离鉴定的210株酵母样真菌以白假丝酵母菌为主，共140株(占66.67%)；其次是热带假丝酵母菌30株(占14.29%)；近平滑假丝酵母菌18株(占8.57%)，见表1。

2.2 药物敏感试验结果

对210株酵母样真菌进行氟康唑、两性霉素B、伏立康唑、卡泊芬净、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑及米卡芬净共7种药物的敏感性实验进行统计分析，发现所有真菌对两性霉素B(100%)、米卡芬净(99.0%)、卡泊芬净(98.1%)、5-氟胞嘧啶(97.1%)敏感性最强，其次为伏立康唑(93.3%)、氟康唑(90.5%)，对伊曲康唑耐药性最强，耐药率为32.4%，见表2。

表1 210株酵母样真菌分类及在不同标本中的分布(株)

表2 酵母样真菌对抗真菌药物的耐药率[%(株)]

3 讨论

近年来，随着超广谱抗生素、肾上腺皮质激素和免疫制剂等应用的增多，介入性治疗手段的不断开展，临床真菌感染不断上升，耐药性也越来越强[2]。本研究显示，在酵母样真菌感染患者中， 标本类型主要是痰和尿液，分别占27.62%、16.19%，年龄＞60岁的患者占到58.1%，提示老年人呼吸系统易受到真菌的侵袭，其属于特殊的易感人群，患有COPD、支气管扩张及肺癌等肺部基础病，而且长期卧床免疫力低下，抵抗力差，长期联合应用广谱抗菌药物引起菌群失调、诱发真菌感染[3]。

在检出的2 1 0株真菌中，白假丝酵母菌占66.67%，与李文波等[3]的报道结果相近，表明白假丝酵母菌在真菌感染中仍占主要地位，其原因是白假丝酵母菌的菌丝对人体的皮肤和黏膜等部位具有较强的粘附力，形成速度快，不易被吞噬，增强了白色念珠菌的致病性，而且白假丝酵母菌较容易形成生物膜，膜内的固着细胞较浮游细胞不易受抗真菌药的影响而耐药性增加[4-5]。本研究中菌株数量位于2、3位的是热带假丝酵母菌(14.29%)和近平滑假丝酵母菌(8.57%)。此外，还检出了数种少见的酵母样真菌，如罗伦隐球菌5例、阿萨希毛孢子菌1例、都柏林假丝酵母菌1例等。罗伦隐球菌属非致病性腐生菌，只是在机体免疫功能受损，抵抗力下降时致病，通常起病隐袭进展缓慢检出困难，临床少见[6]。但在本研究中，罗伦隐球菌检出率为2.38%，对伊曲康唑的耐药率达到60.0%，应引起临床注意。

阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii，T. asahii)是一种条件致病菌，广泛存在于自然界中，国内首次分离鉴定见于杨蓉娅等[7]的研究报道，并与2012年5月完成标准株(CBS 2479)与环境株(CBS 8904)全基因组测序[8]。国外报道多发生于免疫功能低下如恶性肿瘤、恶性血液病、器官移植及HIV感染晚期的患者等，可引起系统性和致命性的感染[9-10]。近年来，在免疫正常人群也有该菌播散性感染的报道[11]。本研究分离的阿萨希毛孢子菌对卡泊芬净、米卡芬净等棘白菌素类药物和5-氟胞嘧啶耐药，对唑类药物和两性霉素B敏感与郭朝霞等[12]研究的体外药物敏感试验一致，可作为经验用药的参考，其耐药机制有待进一步研究。

本研究显示，210株酵母样真菌对7种抗真菌药物存在不同程度耐药，其中两性霉素B的敏感率为100.0%，其原因可能在于两性霉素B毒性大，临床应用较少。对卡泊芬净、米卡芬净的敏感率极高，耐药率＜2.0%，该类抗真菌药物是一类半合成环脂肽类物质，能非竞争性的抑制β-1，3-D-葡聚糖合成酶而阻止真菌细胞壁合成[13]。由于人体细胞无细胞壁、没有β-1，3-D-葡聚糖合成酶这个作用靶点，此类药物对人体细胞影响不大且安全性高。对氟康唑和伏立康唑的敏感度较高，其耐药率均＜7.0%。伊曲康唑敏感性最低，仅为53.3%，其脂溶性高，是临床上常用的药物，但其服用后视觉障碍及皮肤反应较为常见，故不宜长时间服用，伊曲康唑的高耐药率与临床长期滥用抗真菌药物有关，故氟康唑、卡泊芬净可作为真菌治疗的经验用药[14]。

临床上出现真菌合并感染的情况不多见，一般都为单一真菌感染，在本研究中出现4例合并感染。据贺密会等[15]报道，合并感染的病死率较单一感染的高，故比单纯感染危险性大，提示在发生真菌合并感染时，更要加强警惕，积极治疗，以避免死亡的发生。

综上所述，临床微生物室应对送检标本提高真菌的检验手段，准确地分离、鉴定，加强真菌的耐药监测，供临床医师合理选择抗真菌药物。临床医师也要提高对真菌感染的认识，对有使用广谱抗菌药物、老年患者及ICU患者等免疫功能低下患者，要特别注意预防和监测，尽可能避免真菌引起的二重感染，以期达到正确治疗和有效控制真菌感染的目的。

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Research on systematic identification and drug-resistant analysis of yeast-like fungus in clinic

WANG Hong-man, SUN Ming-yan, WANG Bao-qiang, et al// China Medical Equipment,2015,12(3)∶67-70.

Objective∶ Through the system identification of yeast-like fungus, analyze hospital infection and drug-resistant to guide clinical therapy, in order to reduce fungal infections provide the experimental basis. Methods∶ After the isolation and culture of various clinical specimens, tests of fungi identification and drug sensitive were performed by using VITEK 2 Compact Automated microbial identification system, Yeast identification card, ATB Fungus 3 fungal produced by the France BioMerieux company. Results∶ In 210 strains, yeast-like fungal infections were isolated, with Candida, accounting for 97.14%, of which a maximum of Candida albicans, 66.67%, followed by Candida tropical 14.29%. Sputum was detected fungi most, accounting for 27.62%, mainly in elderly patients. The Sensitive rate of itraconazole was lowest, only 53.3%, fluconazole, voriconazole, caspofungin, 5-fluorocytosine and micafungin resistance rates all lower than 7%, amphotericin B resistance rate was 0. Conclusion∶ Candida was the most common infection yeast-like fungi, there were increasing trend of drug resistance. It should strengthen the separation of fungus, identification and monitoring of drug resistance to guide clinical rational drug of choice.

Yeast-like fungus; Systematic identification; Drug-resistace; Trichosporon asahii

王洪曼,女,(1986- ),硕士研究生。潍坊医学院医学检验学系，研究方向：细菌及真菌分类鉴定与耐药性。

2014-05-13

①潍坊医学院医学检验学系 山东 潍坊 261053

②潍坊医学院附属医院检验科 山东 潍坊 261031

*通讯作者：taoyuanyong@163.com