冷冻保护剂种类和胚胎发育阶段对绵羊冷冻胚胎移植受胎率的影响

胡艳芳+梁景山+耿宗帅+杨福+刘海军

摘    要： 对冷冻保护剂种类和胚胎发育阶段对绵羊冷冻胚胎受胎率的影响进行了研究。结果表明： 分别以乙二醇、甘油为冷冻保护剂冷冻保存绵羊囊胚，解冻后移植受胎率差异不显著，表明冷冻保护剂种类对绵羊冷冻胚胎移植受胎率未有明显影响;以乙二醇为冷冻保护剂，冷冻绵羊不同发育阶段的胚胎，囊胚、扩张囊胚解冻后移植受胎率均明显高于桑椹胚的，囊胚和扩张囊胚之间差异不显著，表明胚胎发育阶段对绵羊冷冻胚胎移植受胎率有显著影响。

关键词：乙二醇;甘油;胚胎发育阶段;移植受胎率;绵羊

中图分类号：S814.6             文献标识码：A            DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.008

Effects of Cryoprotectents Kinds and Embryonic Development Stages on Pregnancy Rates of Frozen Sheep Embryos

HU Yan-fang1， LIANG Jing-shan1， GENG Zong-shuai2， YANG Fu2， LIU Hai-jun3

（1. Xiaying Animal Sciences and Veterinary Medicine Station， Tianjin 300193，China; 2. Ji County Animal Health Supervision and Inspection Institute， Tianjin 301900 ，China; 3. Tianjin Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine， Tianjin 300384，China）

Abstract： The effects of cryoprotectents kinds and embryonic development stages on pregnancy rates of frozen sheep embryos were deermined. The results showed that when ethylene glycol and glycerol was used as cryoprotectents separately， no significant difference was found in pregnancy rates of frozen sheep blastocysts， so cryoprotectents kinds had no effects on pregnancy rates. When ethylene glycol was used as cryoprotectents， the pregnancy rates of frozen sheep blastocysts and expanded blastocysts were significantly higher than that of morulas， but no significant difference was found between blastocysts and expanded blastocysts， so cryoprotectents kinds had significant effects on pregnancy rates.

Key words： ethylene glycol; glycerol; embryonic development stages; pregnancy rates; sheep

绵羊胚胎冷冻作为一种引种的手段，在引进国外优良的肉羊品种如杜泊[1-2]、萨福克[3]、无角陶塞特[4]绵羊时，以及在细毛羊育种中[5-6]已经得到广泛应用。

影响胚胎冷冻效果的因素有多种，如胚胎质量、发育阶段、冷冻方法、冷冻保护剂种类、受体发情时间及营养状况等。徐小波等[2]的研究表明，冷冻桑椹胚和囊胚阶段的杜泊绵羊胚胎，移植后的受胎率囊胚显著高于桑椹胚。而王永军等[1]的研究表明，5、6日龄杜泊羊冻胚受胎率显著高于4、7日龄胚胎。 Cocero等[7]对用乙二醇和甘油冷冻保存绵羊的桑椹胚和囊胚的冷冻效果进行了比较，解冻后形态正常的胚胎移植后，用乙二醇冷冻的胚胎体内发育率高于甘油的。

本研究采用程序冷冻法，采用不同的冷冻保护剂，以及对绵羊不同发育阶段的胚胎进行了冷冻保存和移植，目的在于建立一个适宜的绵羊胚胎冷冻保存体系，以获得较为理想的胚胎存活和受胎率，为在绵羊胚胎移植产业化中大规模应用胚胎冷冻技术奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供体羊超数排卵与冲胚

供体绵羊品种为萨福克和道塞特，年龄约2～3岁，舍饲。于供体羊阴道放置CIDA（新西兰）的11～13 d，用促卵泡激素（FSH，Ovagen，新西兰）递减剂量连续超排3 d，每日2次，于最后一次注射FSH时撤栓。供体羊发情后配种，每间隔8～10 h配种1次，直至发情结束。

供体羊于发情的第7天（发情日为0 d）用手术法进行子宫冲胚。选择A级胚胎进行冷冻保存，胚胎发育阶段为致密桑椹、囊胚、扩张囊胚。

1.2 胚胎冷冻

选择A级致密桑椹胚、囊胚、扩张囊胚进行冷冻。冷冻液为1.5 mol·L-1乙二醇和10%甘油（ICP，新西兰）。用两种方法将胚胎加入冷冻液中：①乙二醇，胚胎一步加入冷冻液中，平衡10～20 min;② 甘油：胚胎分3步加入冷冻液中，3%甘油5 min，6%甘油5 min，10%甘油平衡15 min。胚胎冷冻仪为CL5500 （澳大利亚），冷冻程序为：在冷冻液中平衡后的胚胎，装入0.25 mL细管，放入冷冻室，在-6 ℃平衡5 min，植冰，继续平衡10 min，然后以0.5 ℃·min-1降到-35 ℃，平衡10 min后投入液氮。

1.3 胚胎解冻

将胚胎细管从液氮中取出，在空气中停留10 s，然后32 ℃水浴15 s，将胚胎从细管中推出，用两种方法脱出冷冻保护剂：①乙二醇分三步脱除保护剂，在0.5 mol·L-1乙二醇+0.33 mol·L-1蔗糖（以Holding液为基础液）中停留5 min;0.33 mol·L-1蔗糖停留5 min;Holding液洗3次。② 甘油分四步脱保护剂， 6%甘油+0.33 mol·L-1蔗糖5 min;3%甘油+0.33 mol·L-1蔗糖5 min;0.33 mol·L-1蔗糖5 min;Holding液5 min。

解冻后胚胎质量的评价： A级胚胎，形态恢复完整，胚胎细胞团紧凑;B级胚胎，透明带破裂，或少量细胞游离出细胞团;C级胚胎，透明带脱落或内细胞团发散。移植A、B级胚胎。

1.4 受体绵羊的同期发情和胚胎移植

受体绵羊为经产的小尾寒羊，年龄2～4岁，舍饲。注射前列腺素（上海）进行同期发情处理。选择发情第7天（发情日为0 d）的受体羊，采用腹腔镜进行子宫移植，胚胎移植于黄体好的一侧子宫角，每只羊移植1枚胚胎。

1.5 妊娠诊断

胚胎移植后2个月，用B超机进行妊娠检查，以观察到胎儿为妊娠依据。

2 结果与分析

2.1 冷冻保护剂种类对受胎率的影响

分别以乙二醇、甘油为冷冻保护剂，冷冻萨福克和道塞特绵羊的囊胚，比较冷冻保护剂种类对绵羊冷冻胚胎移植受胎率的影响。结果表明，以乙二醇、甘油为冷冻保护剂，冷冻胚胎移植受胎率分别为54.3%和51.5%，差异不显著（P>0.05），表明冷冻保护剂种类对绵羊冷冻胚胎移植受胎率未有明显影响， 结果见表1。

2.2 胚胎发育阶段对受胎率的影响

以乙二醇为冷冻保护剂，冷冻萨福克和道塞特绵羊的桑椹胚、囊胚和扩张囊胚，比较不同胚胎发育阶段对绵羊冷冻胚胎移植受胎率的影响。结果表明，囊胚、扩张囊胚解冻后移植受胎率（59.6%，62.2%）均明显高于桑椹胚的（40.2%）（P<0.05），囊胚和扩张囊胚之间差异不显著（P>0.05）。表明胚胎发育阶段对绵羊冷冻胚胎移植受胎率有显著影响，囊胚和扩张囊胚的受胎率高于桑椹胚的，结果见表2。

3 讨  论

3.1 胚胎冷冻保护剂的类型对冷冻效果的影响

笔者在冷冻胚胎的过程中发现，使用甘油作冷冻保护剂，胚胎放入甘油中与乙二醇中的渗透行为是不同的，乙二醇渗入胚胎内的速度很快，因此在显微镜下几乎观察不到胚胎形态的变化，而胚胎放入甘油中，胚胎发生严重皱缩，这是由于甘油分子量大，渗透入胚胎的速度慢，胚胎脱水造成的，随着甘油渗入胚胎，细胞内外渗透压达到平衡，胚胎才恢复原来的形状。本研究从绵羊冷冻胚胎的移植受胎率看，甘油和乙二醇作冷冻保护剂的受胎率并没有什么明显差异，表明二者作为胚胎冷冻保护剂均是可行的。Cocero等[7]的研究表明，用乙二醇冷冻绵羊胚胎，比用甘油解冻后存活率高（64.4%比16.0%）;解冻后形态正常的胚胎移植后，用乙二醇冷冻的胚胎体内发育率高于甘油（45.5%比27.7%），并因此得出结论用乙二醇冷冻绵羊胚胎比甘油效果好。这与本研究的结果有所不同，这可能与添加和脱除冷冻保护剂的方法不同以及受体等其它因素有关。Cocero等[8]进一步揭示了用这两种冷冻保护剂冷冻解冻的绵羊胚胎的超微结构的特点，结果表明，用乙二醇冷冻的胚胎的卵裂球保持了高度的一致性，而用甘油冷冻的胚胎卵裂球受保护程度与卵裂球所处位置有关，尤其在桑椹胚，位于外部的卵裂球保存完整，而位于内部的卵裂球完全破坏。

最初的胚胎冷冻所用的冷冻保护剂主要是甘油，在不同动物的胚胎冷冻中表现了其有效性。由于甘油分子量较大，渗透速度慢，需要分步添加，较为繁琐，不便于在胚胎移植产业化中应用。目前的胚胎冷冻多采用乙二醇作冷冻保护剂，乙二醇分子量小，渗透速度快，因此需要的平衡时间短，可一步添加。

3.2 胚胎发育阶段对冷冻效果的影响

用于冷冻的胚胎通常处于桑椹胚、囊胚、扩张囊胚阶段，处于不同发育阶段的胚胎，其外观形态和细胞数量及特性均有所不同，对冷冻的耐受能力也存在差异。本研究的结果表明，绵羊囊胚、扩张囊胚冷冻解冻后移植受胎率均明显高于桑椹胚的，囊胚和扩张囊胚之间差异不显著，表明胚胎发育阶段对绵羊冷冻胚胎移植受胎率有显著影响。这与徐小波等[2]的研究结果相似，冷冻桑椹胚和囊胚阶段的杜泊绵羊胚胎，移植后的受胎率囊胚为61.5%，显著高于桑椹胚 （41.5%）（P<0.01）。王丽娟等[9]、 陈永昌等[10]的研究也表明，绵羊冷冻胚胎囊胚的受胎率高于桑椹胚的。而王永军等[1]则得出5、6日龄杜泊羊冻胚受胎率 （65.12%，63.64%） 显著高于4、7日龄胚胎的（43.75%，45.45%）（P<0.01）。

从整体上看，冷冻发育阶段晚的胚胎的受胎率高于早期的胚胎的。这其中的可能原因是，发育阶段晚的囊胚和扩张囊胚，其细胞数要较发育阶段早的桑椹胚的细胞数多，而且细胞体积变小。与体积小的细胞相比，体积大的细胞不易充分脱水，因此冷冻效果差，这也是为什么卵母细胞和早期卵裂阶段的胚胎不易冷冻成功的原因[11]。因此冷冻发育阶段晚的胚胎的效果要好。

尽管使用羊胚胎的冷冻技术取得了较好的受胎率，但冷冻过程对细胞形态和代谢上的影响仍制约冷冻保存的成功率。常规的冷冻法并不能很好地保护细胞，避免冷冻所带来的损伤，因此还需要进一步完善胚胎冷冻保存体系[12]。

总之，采用常规的慢速冷冻方法，用乙二醇和甘油做冷冻保护剂，均能取得较高的受胎率，表明二者用于绵羊胚胎冷冻均是可行的，但考虑到在添加冷冻保护剂过程中甘油较乙二醇繁琐，所以在胚胎移植产业化中用乙二醇较为合适。胚胎发育阶段对移植受胎率有显著影响，绵羊囊胚、扩张囊胚冷冻解冻后移植受胎率均明显高于桑椹胚的，因此，囊胚和扩张囊胚是绵羊胚胎冷冻的适宜发育阶段。

参考文献：

[1] 王永军，田秀娥，陈玉林，等. 胚龄对Dorper羊冷冻胚胎移植效果的影响研究[J]. 中国农学通报， 2003， 19 （5）：10-11.

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[3] 赵晏，雷英鹏，张居农，等. 萨福克肉羊冷冻胚胎的移植效果观察[J]. 黑龙江动物繁殖，2007，15（2）： 20-21.

[4] 李光梅，李光平. 无角陶赛特羊冷冻胚胎移植试验及其适应性观察[J]. 黑龙江畜牧兽医，2010（3）：70-71.

[5] 乌力吉，李春生，丹巴，等. 内蒙古鄂尔多斯市澳美型细毛羊冷冻胚胎移植技术应用效果[J]. 畜牧与饲料科学，2012，33（1）：1-3.

[6] 陈新华，谭先伟，倪建宏，等. 超细毛羊冷冻胚胎移植报告[J]. 黑龙江动物繁殖，2012，22（2）： 18-20.

[7] COCERO M J， SEBASTIAN A L， BARRAGAN M L， et al. Differences on post-thawing survival between ovine morulae and blastocysts cryopreserved with ethylene glycol or glycerol[J]. Cryobiology. 1996， 33（5）：502-507.

[8] COCERO M J， Diax de la Espina S M， Aguilar B. Ultrastructural characteristics of fresh and frozen-thawed ovine embryos using two cryoprotectants[J]. Biology of Reproduction， 2002， 66（5）：1244-1258.

[9] 王丽娟，李武，张广民. 优质肉羊冷冻胚胎移植技术的研究应用[J]. 上海畜牧兽医通讯，2003（1）： 29.

[10] 陈永昌，王继，和占星，等. 杜泊羊冷冻胚胎批量移植试验[J]. 黑龙江畜牧兽医，2004（10）：32-34.

[11] 刘海军，杨晓玲，池炳杰. 家畜卵母细胞冷冻保存研究进展[J]. 畜牧兽医杂志，2007，26（4）：23-26.

[12] 刘静静，刘月琴. 羊胚胎冷冻保存研究进展[J].中国草食动物，2014（S1）：21-23.