熊果酸衍生物的合成及其对H2O2损伤PC12细胞的保护作用

叶 辉，李齐激，史亚男，杨 艳，杨付梅，杨小生*

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563099;2.贵州省中国科学院天然产物重点实验室，贵州 贵阳 550002)

氧化应激是体内一种重要的病理生理反应，主要是自由基产生过多或抗氧化物质水平减少而使两者之间的平衡失调，从而造成的细胞老化或损伤;生物体组织器官的老化与氧化应激有直接关系，特别是神经系统的氧化应激造成神经性疾病，如:帕金森病、阿尔茨海默病［1-3］。研究发现通过抗过氧化氢(H2O2)诱导细胞DNA损伤能较好地反应抗氧化、细胞保护作用［4］。熊果酸(Ursolic acid)是一种广泛存在于天然植物中五环三萜类化合物，具有广泛的生物活性，包括抗氧化活性［5］，人脐静脉内皮细胞［6］、心肌细胞［7］、肝细胞保护作用［8］，抗氧化应激效应是较为认可的作用机制之一［9］。在以熊果酸为先导物进行结构修饰，从而筛选抗氧化应激活性物质的进程中，前人做了大量工作，初步证实五环三萜化合物的抗氧化活性与取代位置、取代基团、分子构象等关系密切，尤其是羟基取代及其数目［10-11］。本实验拟通过增加熊果酸C1-3位的羟基数目和C28位取代基团，合成系列1，2，3-三羟基熊果酸及其衍生物，并运用MTT法对目标产物的细胞毒性、H2O2损伤PC12细胞保护活性进行筛选，初步探讨其构效关系，为进一步药物筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

熊果酸购自贵州省迪大科技有限公司(纯度90%);WGH-30型双光束红外分光光度计测定，KBr压片;Varian INOVA 400 NHz核磁共振仪，TMS为内标，CDCl3和CD3OD为溶剂;HP-5973型质谱仪;XT-4显微熔点测定仪(控温型)，温度未经校正;各种试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 合成方法

以熊果酸为原料，先苄基化得中间体2，再在甲基磺酰氯作用下的中间体3，经碳酸锂处理得中间体4，通过二氧化硒氧化得5，再经NaOH水溶液处理脱羧得6，中间体6在间氯过氧苯甲酸作用下环氧得7，经高氯酸水解得9，最后采用钯碳催化氢化的 1，2，3- 三羟基熊果酸(10)［12］，进而对 10 的C-28位进行衍生得11-15。合成路线见Scheme 1。

1.2.1 化合物7-10的合成 取300 mg(0.551 mmol)6，加入50 mL的二氯甲烷溶解，再加入254 mg(1.102 mmol)间氯过氧苯甲酸，氮气保护下室温反应4 h，氯仿萃取，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥有机相，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1，V/V)纯化得7(270 mg)。

图1 合成路线Fig.1 Synthesispathway

取50 mg(0.089 mmol)7，加入20 mL的甲醇溶解，再加47 mg(0.445 mmol)钯炭，用油泵边抽除空气边注入氢气，反复三次，在氢气保护下反应10 h，滤除钯炭，减压除去甲醇，加入适量水分散后，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥有机相，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析 (石油醚∶丙酮=2∶1，V/V)纯化得8(39 mg)。

取200 mg(0.357 mmol)7，加入 20 mL 的 1，4-二氧六环溶解，冰浴下缓慢加入101 μL(1.785 mmol)高氯酸，两滴蒸馏水。氮气保护下油浴60℃反应8 h，加入10 mL水，搅拌0.5 h，减压除去部分1，4-二氧六环，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥有机相，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮=2∶1，V/V)纯化得9(63 mg)。

参照化合物8的制备方法，由化合物9(100 mg，0.173 mmol)，钯炭(92 mg，0.865 mmol)，制备得10(77 mg)。

1.2.2 化合物11-15的合成 化合物11的制备取100 mg(0.205 mmol)10，加入20 mL的 DMF溶解，再加141 mg(1.025 mmol)K2CO3，氮气保护下常温反应8 h，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥有机相，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮=1∶1，V/V)纯化得11(107 mg)。

化合物12的制备取50 mg(0.084 mmol)11，加入20 mL的乙醇溶解，加入1 mL水，在加入42.4 mg(0.420 mmol)的三乙胺，氮气保护下回流1 h，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥有机相，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮=1∶1，V/V)纯化得12(36 mg)。

化合物13的制备取50 mg(0.084 mmol)11，加入20 mL的DMF溶解，再加58 mg(0.420 mmol)K2CO3，分别加入12.3 mg(0.168 mmol)的二乙胺，氮气保护下常温反应8 h，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥有机相，减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮=1∶2，V/V)纯化得13(33 mg)。

化合物14的制备参照化合物13的制备方法，由化合物 11(50 mg，0.084 mmol)，N-甲基哌嗪(42 mg，0.420 mmol)，K2CO3(58 mg，0.420 mmol)，制备得14(39 mg)。

化合物15的制备参照化合物13的制备方法，由化合物11(50 mg，0.084 mmol)，二乙醇胺(44 mg，0.420 mmol)，K2CO3(58 mg，0.420 mmol)，制备得15(42 mg)。

1.3 抗过氧化氢损伤PC12细胞活性测试

1.3.1 细胞毒性测试 将PC12细胞悬液稀释成5×104cells·well-1，种于96孔细胞培养板中，每孔 100 μL，放置在 37℃，5%CO2，100% 相对湿度的培养箱中培养24 h后，在各孔中分别加入不同浓度的受试化合物(终浓度为1.0×10-4，1.0×10-5，1.0×10-6mol/L)，不加受试化合物为空白对照组，每个浓度组制备4个复孔，在相同条件下，继续培养48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出培养基，每孔加100 μL二甲基亚砜溶解结晶，微型振荡5 min后，用酶标仪在490 nm～570 nm下测定各孔吸光度(A值)，各浓度组均取4次测定平均值［13］。通过与对照组的比较计算实验组的细胞毒性。

细胞毒性=(1-实验组A值/对照组A值)×100%

1.3.2 抗过氧化氢损伤PC12细胞活力测试 采用MTT法测试了化合物7-15对细胞毒性和抗过氧化氢损伤细胞PC12活力测试，阳性对照药为维生素E。实验以PC12细胞1×104cells·well-1种于96孔细胞培养板，培养24 h后弃上清，按以下分组:①空白对照组:加入无血清PC12细胞培养基;②模型组:加入200 μmol/L的 H2O2继续培养24 h;③受试化合物低剂量组(终浓度为1.0×10-6mol/L);④受试化合物中剂量组(终浓度为1.0×10-5mol/L);⑤受试化合物高剂量组(终浓度为1.0×10-4mol/L)，分别加入不同浓度受试化合物处理24 h后，再加入200 μmol/L H2O2继续培养24 h。⑥阳性对照组:分别加入上述高中低三个浓度的维生素E处理24 h后，再加入200 μmol/L H2O2继续培养24 h。用酶联免疫检测仪在波长为570 nm处测定每个孔的吸光度，并计算细胞保护率。

细胞保护率=(实验组OD值/正常细胞组OD值)×100%。

2 结果与讨论

2.1 化合物的光谱数据

化合物7白色固体，产率:87.4%，mp 52～55℃;IR(KBr)υmax3 448，2 923，1 720，1 457，1 386 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.35(m，5H，Ar-H)，5.25(s，1H，-CH=)，5.12 ～ 4.95(dd，2H，CH2-)，3.51 ～ 3.50(d，1H，J=5.6Hz，OCH-)，3.46 ～ 3.44(dd，1H，OCH-)，3.00 ～2.99(d，1H，J=3.6Hz，OCH-)，1.08，1.08，1.00，0.82，0.64(s，15H，5CH3)，0.95 ～ 0.93(d，3H，J=8.0Hz，CH3)，0.89 ～ 0.88(3H，d，J=4.0Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.3，137.7，136.3，128.3，128.3，128.0，128.0，127.8，125.7，67.0，65.9，64.9，55.9，52.7，48.1，42.3，40.3，40.2，39.1，38.8，38.7，36.6，35.7，32.4，31.8，30.6，29.6，27.8，24.2，23.3，22.8，22.3，21.8，18.6，17.0，17.0，15.7;ESI-MS m/z:583 ［M+Na］+。

化合物8白色固体，产率:92.9%，mp 258～260 ℃;IR(KBr)υmax3 443，2 925，1 691 cm-1;1HNMR(CD3OD，400 MHz)δ:5.23(s，1H，-CH=)，3.56 ～3.55(d，2H，J=4.8Hz，OCH-)，3.46～3.44(dd，1H，OCH-)，2.99 ～2.98(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，1.12，1.08，1.01，0.95，0.84(s，15H，5CH3)，0.94 ～0.92(d，3H，J=4.8Hz，CH3)，0.88 ～ 0.86(3H，d，J=6.0Hz，CH3);13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ:182.1，139.3，127.0，68.9，65.0，64.9，56.7，54.5，43.7，41.6，41.4，40.5，40.4，40.1，38.1，36.9，33.5，33.2，31.7，29.2，28.4，25.3，24.1，24.0，22.7，21.6，19.8，17.9，17.6，16.7;ESI-MS m/z:493 ［M+Na］+。

化合物9白色固体，产率:30.6%，mp 252～254 ℃;IR(KBr)υmax3 441，2 924，1 722，1 455，1 377 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.35(m，5H，Ar-H)，5.26(s，1H，-CH=)，5.12 ～4.96(dd，2H，CH2-)，3.79 ～ 3.82(m，1H，J=3.6Hz，OCH-)，3.63 ～ 3.65(d，1H，J=8.4Hz，OCH-)，3.43 ～3.45(d，1H，J=4.4Hz，OCH-)，1.11，1.06，0.87，0.85，0.65(s，15H，5CH3)，1.03～1.01(d，3H，J=8.0Hz，CH3)，0.94 ～ 0.93(d，3H，J=4.0Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.3，138.4，136.2，128.3，128.3，128.1，128.1，127.9，125.2，74.5，73.7，76.0，65.9，52.7，47.9，48.0，42.4，40.1，39.3，39.0，38.7，38.4，38.1，36.6，32.3，30.5，29.5，27.8，24.1，23.7，23.1，21.1，17.8，17.2，17.0，14.1;ESI-MS m/z:601［M+Na］+。

化合物10白色固体，产率:91.7%，mp 297～299 ℃;IR(KBr)υmax3 450，2 926，1 691 cm-1;1HNMR(CD3OD，400 MHz)δ:5.27(s，1H，-CH=)，4.00(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.68(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.45(d，1H，J=3.2Hz，OCH-)，1.28，1.23，1.13，1.00，0.87(15H，s，5CH3)，0.96 ～ 0.94(d，3H，J=4.0Hz，CH3)，0.90～0.89(d，3H，J=5.2Hz，CH3);13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ:180.5，139.5，127.1，77.4，75.3，74.9，49.6，47.6，47.2，43.4，42.7，41.5，40.3，39.7，39.3，39.2，34.8，33.8，33.6，33.5，30.1，28.8，26.5，24.4，24.0，24.0，19.1，18.1，17.8，14.8;ESI-MS m/z:511［M+Na］+。

化合物11无色油状物，产率:87.7%，bp 95～97 ℃;IR(KBr)υmax3 425，2 928，1 727，1 532，1 456 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.27(s，1H，-CH=)，4.33 ～ 4.30(t，2H，J=6Hz，CH2-)，3.95(d，1H，J=5.6Hz，OCH-)，3.70(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.54(d，1H，J=4.0Hz，OCH-)，3.51 ～ 3.48(t，2H，J=6Hz，CH2-)，1.28，1.20，1.11，1.00，0.80(s，15H，5CH3)，0.94 ～ 0.95(d，3H，J=6.0Hz，CH3)，0.86 ～ 0.87(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.2，138.1，125.1，77.3，77.0，76.7，73.8，63.6，52.7，48.1，42.5，40.3，39.4，38.9，38.8，38.3，38.1，36.7，32.3，30.6，29.6，29.0，27.9，24.1，23.7，23.2，21.1，17.8，17.4，17.0，14.5，14.1;ESI-MS m/z:618［M+Na］+。

化合物12白色固体，产率:80.5%，mp 159～161 ℃;IR(KBr)υmax3 425，2 925，1 724，1 644，1 457 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.24(s，1H，-CH=)，4.15 ～ 4.12(t，2H，J=6.0Hz，CH2-)，4.02(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，3.74(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，3.54(d，1H，J=4.0Hz，OCH-)，2.72 ～2.70(t，2H，J=5.6Hz，CH2-)，2.37 ～2.00(m，8H，CH2-)，2.00(s，3H，CH3)，1.21，1.11，1.02，0.97，0.79(s，15H，5CH3)，0.95 ～0.94(d，3H，J=4.8Hz，CH3)，0.88 ～ 0.86(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.4，138.4，125.3，77.3，77.0，76.1，76.1，74.4，73.7，61.8，56.3，54.5，52.7，52.6，48.0，47.9，45.4，42.5，40.3，39.4，39.0，38.4，38.3，38.2，36.7，32.4，29.6，24.2，23.7，23.2，21.2，17.9，17.4，17.3，17.1，14.2;ESI-MS m/z:637 ［M+Na］+。

化合物13白色固体，产率:66.9%，mp 124～126 ℃;IR(KBr)υmax3 430，2 927，1 724，1 457 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.25(s，1H，-CH=)，4.14 ～ 4.11(t，2H，J=7.2Hz，CH2-)，4.02(d，1H，J=3.6Hz，OCH-)，3.73(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.54(d，1H，J=4.4Hz，OCH-)，2.75 ～2.73(t，2H，J=6.8Hz，CH2-)，2.63 ～2.58(dd，4H，CH2-)，1.21，1.07，1.02，0.96，0.80(s，15H，5CH3)，1.14 ～ 1.05(m，6H，2CH3)，0.93 ～0.95(d，3H，J=6.0Hz，CH3)，0.85 ～0.87(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.5，138.3，125.3，77.3，77.0，76.7，76.0，74.4，73.8，61.2，60.4，52.8，50.5，48.0，47.9，47.4，42.5，40.3，39.4，39.0，38.8，38.3，36.6，32.4，30.4，29.6，27.9，24.1，23.7，23.2，21.2，17.9，17.4，17.3，17.2，14.2;ESI-MS m/z:610 ［M+Na］+。

化合物14白色固体，产率:75.6%，mp 147～149 ℃;IR(KBr)υmax3 442，2 949，1 644，1 463，1 429 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.26(s，1H，-CH=)，4.12 ～ 4.10(t，2H，J=6.0Hz，CH2-)，4.03 ～ 4.02(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，3.75(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.64 ～3.62(t，4H，J=5.2Hz，CH2-)，3.55(d，1H，J=4.0Hz，OCH-)，2.84 ～2.81(t，2H，J=6.8Hz，CH2-)，2.75 ～2.72(t，4H，J=5.6Hz，CH2-)，1.21，1.10，1.02，0.97，0.79(s，15H，5CH3)，0.94 ～ 0.93(d，3H，J=6.4Hz，CH3)，0.86 ～ 0.85(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.8，138.4，125.3，77.3，77.0，76.8，76.1，74.5，73.8，61.9，59.8，56.3，52.8，48.1，47.9，42.5，40.3，39.3，39.0，38.8，38.4，38.0，36.7，32.3，30.6，29.6，27.9，24.2，23.7，23.2，21.1，17.9，17.4，17.2，17.1，14.2;ESI-MS m/z:642 ［M+Na］+。

化合物15白色固体，产率:80.8%，mp 142～145 ℃;IR(KBr)υmax3 442，2 949，1 708，1 635，1 456 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.28(s，1H，-CH=)，4.23 ～4.19(m，2H，CH2-)，4.11 ～4.03(m，2H，CH2-)，3.80(s，1H，OCH-)，3.74(s，1H，OCH-)，3.54(s，1H，OCH-)，1.20，1.12，1.02，0.94，0.81(s，15H，5CH3)，0.96(d，3H，J=2.8Hz，CH3)，0.87 ～ 0.86(d，3H，J=5.2Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.9，139.3，125.0，77.3，77.0，76.8，63.9，61.3，52.9，48.3，48.0，42.7，40.3，39.4，39.1，38.8，38.4，38.2，36.7，32.4，30.6，29.6，27.8，24.2，23.7，23.2，21.1，17.8，17.4，17.2，17.1，14.2;ESI-MS m/z:555［M+Na］+。

2.2 细胞毒性

由表1可知，UA细胞毒性较小，在浓度1.0×10-4、1.0×10-5、1.0 ×10-6mol/L 下细胞的死亡率为6.69%、8.37%、9.78%;化合物 7、9、11、12、14有明显的细胞毒性，在浓度为1.0×10-4mol/L细胞的死亡率分别为 85.17%，87.27%，84.20%，88.31%，85.08%;化合物10的细胞毒性小于UA，衍生物13、15无细胞毒性。

表1 化合物对PC12细胞的毒性Tab.1 The toxicity of compounds on PC12 cells

2.3 抗过氧化氢损伤PC12细胞活性

表2 化合物对抗过氧化氢损伤PC12细胞的保护率Tab.2 The protection rate of compounds against H2O2induced damage of PC12 cells

由表2可知，UA无抗过氧化氢损伤PC12细胞活性，化合物10有微弱的抗过氧化氢损伤PC12细胞活性，13、15抗过氧化氢损伤PC12细胞活性较好，在1.0×10-4mol/L水平，对过氧化氢损伤PC12细胞抑制率分别为35.93%，40.18%，尤其是15，抑制率高于阳性对照(维生素E)。

综上，构效关系结果分析如下:(1)UA母环上引入三个羟基后，细胞毒性降低，抗过氧化氢损伤PC12细胞活性增强。(2)在三羟基熊果酸C-28引入溴乙烷、N-甲基哌嗪、羟基乙烷(11、12、14)显著增强了其对细胞的毒性。(3)在三羟基熊果酸C-28引入脂肪碳后，再引入二乙胺基、二乙醇胺基(13、15)，可显著降低细胞毒性，且明显增强抗过氧化氢损伤PC12细胞活性，其中引入二乙醇胺基的抗过氧化氢损伤PC12细胞活性强于阳性对照维生素 E。(5)化合物 UA、10、14、15比较，化合物14在高浓度时有明显的细胞毒性，可能引入的乙烷基团是细胞毒性基团，但在低浓度1.0×10-5mol/L对过氧化氢损伤PC12细胞也有明显的保护活性，化合物UA、10、14随着羟基数目增多，其抗过氧化氢损伤PC12细胞活性逐渐增强。

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