康复灵颗粒质量标准研究

2015-12-02贾晓斌张勇妹郭贵宾

医学研究生学报 2015年10期

丁妍，丁敏，贾晓斌，张勇妹，郭贵宾，孙锐，林梅

0 引言

康复灵颗粒由黄芪、当归、桑葚等5味中药制成，临床上主要用于治疗辐射损伤。方中，君药黄芪为中医常用的重要补气药，所含黄酮、皂苷、多糖类化合物为其主要活性成分［1-4］。当归具有补血活血的作用，在防治辐射方面应用广泛［5-6］。但相关标准尚未建立，为有效控制本制剂质量，本文采用薄层色谱法对方中黄芪、当归进行定性鉴别，同时采用高效液相色谱法对黄芪甲苷进行定量测定，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Waters，600型泵，717自动进样器，蒸发光散射检测器检测器，Empower数据处理系统)。康复灵颗粒 (由解放军第三五九医院提供);黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:110781-201314);阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:110773-201313);乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 黄芪鉴别方法参照文献［7-8］，取本制剂6 g，加甲醇40 mL，水浴，回流提取1 h，过滤，上样于中性Al2O3柱(100～120目，5 g，内径为10～15 mm)。用40%甲醇200mL洗脱，将收集的洗脱液水浴蒸干，然后加水60 mL溶解残渣，用水饱和的正丁醇溶液萃取2次，每次40 mL，将正丁醇萃取液合并后用水洗涤2次，每次40mL，水浴蒸干正丁醇液，加甲醇1 mL溶解残渣，作为供试品溶液。按照处方比例制成缺黄芪药材的阴性样品，并按供试品溶液的制备方法制成缺黄芪的阴性样品溶液。称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，制备成1mg/mL的对照品溶液。按照薄层色谱法进行操作，分别吸取上面所述3种溶液各2 μL，点样于同一块硅胶G薄层板上，三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液作为展开剂，将点样的薄层板放于展开缸中展开，待展开剂展开至目标前沿位置取出，通风橱中晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，喷完后用烘箱加热，至斑点显色清晰取出。供试品的色谱图中，与对照品色谱对应的位置上，日光下显示相同的棕褐色斑点，阴性对照无斑点，紫外灯(365 nm)下显示相同的荧光斑点，阴性对照无斑点，见图1。

2.1.2 当归鉴别方法参照文献［9-10］，取本制剂6 g，加1%NaHCO3溶液50 mL，超声提取 10 min，离心，上清液用稀HCl调节pH值至2～3，乙醚萃取2次，每次40mL，将乙醚液合并后挥干，加甲醇1mL溶解残渣，作为供试品溶液。按照处方比例和制法制成缺当归药材的阴性颗粒剂，并按照供试品溶液的制备方法制成缺当归的阴性样品溶液。称取阿魏酸对照品适量，加甲醇溶解，制备成1mg/mL的对照品溶液。按薄层色谱法进行操作，分别吸取上面所述3种溶液各10 μL，点样于同一块硅胶G薄层板上，环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)作为展开剂，将点样的薄层板放于展开缸中展开，待展开剂至目标前沿位置取出，通风橱中晾干，放在紫外灯箱(365 nm)下观察。与对照品色谱对应的位置上，供试品显相同颜色的荧光斑点，阴性对照液在该位置无此斑点。见图2。

图1 黄芪甲苷薄层色谱Figure 1 Identification of as tragalosideⅣby TLC

图2 当归薄层色谱鉴别Figure 2 Identification of ferulaic acid

2.2 含量测定

2.2.1 黄芪含量测定 ①色谱条件，色谱柱:Agilent Zorbax Extend-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(32∶68)，ELSD 检测;流速1.0 mL/min;柱温:35℃。②对照品储备液的制备，称取黄芪甲苷对照品，精密称定，置容量瓶中加甲醇溶解并稀释至容量瓶刻度，制成1.53mg/mL的母液。③供试品溶液的制备，取本品约10 g，用分析天平精密称定，放在索氏提取器中，用甲醇100 mL冷浸24 h，然后加甲醇适量，水浴，回流提取4 h，回收溶剂，蒸干，加水10 mL溶解残渣，用水饱和的正丁醇溶液萃取4次，每次40 mL，合并萃取液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，水浴蒸干正丁醇液，加水5 mL溶解残渣，放冷，上样于D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5 cm，柱高为 12 cm)，依次用水 50 mL、40% 乙醇30 mL、70%乙醇80 mL洗脱，收集最后的洗脱液，水浴蒸干，加适量甲醇溶解残渣，转移至5 mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。④线性关系考察，精密量取对照品储备液 0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成黄芪甲苷标准系列溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL，以浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归。得到回归方程:

Y=5.9 ×107X-42572

R2=0.999(n=5)，结果表明黄芪甲苷在0.0306～0.6120 mg/mL范围内峰面积与浓度线性关系良好。⑤精密度试验，精密吸取“2.2.2”项下第3 份对照品溶液20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL，重复操作6次，记录色谱峰面积。计算黄芪甲苷的峰面积RSD为1.89%，表明本方法精密度良好。⑥重复性考察，分别精密称取同一批号康复灵颗粒6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“3.1.1”项下色谱条件进样 20 μL，记录色谱峰面积。计算黄芪甲苷的峰面积RSD为1.58%，表明本方法重复性良好。⑦稳定性考察，取同一康复灵颗粒供试品溶液，于室温放置，分别于2、4、6、8、12、18、24 h 按“2.2.1”项下色谱条件进样 20 μL，记录色谱峰面积。计算黄芪甲苷峰面积的RSD为2.17%，表明供试品溶液在24 h内稳定。⑧加样回收率考察，供试品取样量为原样品量的50%，根据被测成分含量，按1∶1加入黄芪甲苷对照品各6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样 20 μL，记录色谱峰面积。结果黄芪甲苷的平均加样回收率为101.26%，表明本方法回收率良好。⑨样品中黄芪甲苷含量测定，取康复灵颗粒10批，按“2.2.1”项下方法制备溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷的含量。

根据上述测定结果，暂定本品按干燥品计算，每克含黄芪甲苷(C41H68O14)的量不得少于0.19 mg。10个批次康复灵颗粒中黄芪甲苷分别为0.231、0.245、0.239、0.242、0.228、0.221、0.229、0.235、0.246、0.253 mg/g。

2.2.2 当归含量测定 ①色谱条件，色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱 (250mm ×4.6mm，5μm);流动相:乙腈-0.085%磷酸水(17∶83)，检测波长:320 nm;流速1.0 mL/min;柱温:35℃。②对照品储备液的制备，取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成12 μg/mL的母液。③供试品溶液的制备，取本品约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。④线性关系考察，精密量取对照品储备液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成阿魏酸标准系列溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样 20 μL，以浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归。得到回归方程:

Y=4.4 ×106X+7342

R2=0.999(n=5)，结果表明黄芪甲苷在0.24 ～4.80μg/mL范围内峰面积与浓度线性关系良好。⑤精密度试验，精密吸取“2.2.2”项下第3份对照品溶液20 μL，按“2.2.2”项下色谱条件进样 20 μL，重复操作6次，记录色谱峰面积。计算阿魏酸的峰面积RSD为0.83%，表明本方法精密度良好。⑥重复性考察，分别精密称取同一批号康复灵颗粒6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样20μL，记录色谱峰面积。计算阿魏酸的峰面积RSD为1.14%，表明本方法重复性良好。⑦稳定性考察，取同一康复灵颗粒供试品溶液，于室温放置，分别于 2、4、6、8、12、18、24 h 按“2.2.2”项下色谱条件进样20μL，记录色谱峰面积。计算阿魏酸峰面积的RSD为1.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定。⑧加样回收率考察，供试品取样量为原样品量的50%，根据被测成分含量，按1∶1加入阿魏酸对照品各6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样20 μL，记录色谱峰面积。结果阿魏酸的平均加样回收率为98.39%，表明本方法回收率良好。⑨样品中阿魏酸含量测定，取康复灵颗粒10批，按“2.2.2”项下方法制备溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，用外标一点法计算阿魏酸的含量。

根据上述测定结果，暂定本品按干燥品计算，每克含阿魏酸(C10H10O4)的量不得少于0.08 mg。10个批次康复灵颗粒中阿魏酸含量分别为0.092、0.103、0.112、0.096、0.115、0.086、0.082、0.107、0.094、0.088 mg/g。

3 讨论

对康复灵颗粒中臣药当归进行含量测定前，需对其进行提取。近年来，关于当归的提取的方法主要有水提、醇提、超临界流体萃取及双提等工艺［11］。鉴于阿魏酸在醇提取液中浓度高于水煎液，在提取康复灵颗粒时舍弃水提取工艺。查阅药典及相关文献，我们采用70%甲醇对康复灵颗粒进行提取［9］。

伴随着放射性核素在医疗、能源、战争等方面的普遍应用，人们愈来愈重视核辐射对机体的损伤及医学防护。长期以来，虽然人们致力于寻找安全有效、价格合理的抗放疗药物，但是成效甚微。近年来，研究发现中药在抗辐射方面具有独特的优势，吸引了越来越多的科学家关注［12-14］。中医认为辐射造成机体气血受损，其基本病理机制是气血两虚及血瘀。本制剂中当归、黄芪具有补气补血活血的作用，其经典组方当归补血汤在临床上更加应用广泛。

本研究建立了抗辐射中药康复灵颗粒的质量标准，希望可为同类型抗辐射中药质量标准的制定提供技术参考。通过质量标准的研究，实现全面准确地控制康复灵颗粒质量，确保并提高其安全性、有效性，以便更好地服务于临床。本研究所建立的方法操作简便、灵敏度高、准确可靠、重现性好，可作为康复灵颗粒的质量控制方法。

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