应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

叶惠仪，丁妙霞，黄江志，黄炳炽，黄育浩，张险朋

（1.广东省东莞市横沥镇农业技术服务中心，广东 东莞 523460；2东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

叶惠仪1，丁妙霞1，黄江志1，黄炳炽2，黄育浩2，张险朋2

（1.广东省东莞市横沥镇农业技术服务中心，广东 东莞 523460；2东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

为了验证荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的可行性，应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原评估检测方法的特异性，检测不同稀释度的H7N9亚型禽流感抗原，并用建立的方法检测采自三鸟批发市场100份泄殖腔、喉拭子。结果是建立的荧光RT-PCR方法，H7体系能检测出1：10-10抗原稀释度，N9体系能检测1：10-9抗原稀释度，对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应；检出100份泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。结果表明，荧光RT-PCR方法H7N9亚型禽流感病毒具有快速、灵敏、特异的特点，适合对禽类的大规模监测。

H7N9亚型禽流感；荧光RT-PCR；禽类；检测

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，病毒基因组由8个单股负链RNA组成，编码10种蛋白，根据糖蛋白HA和NA的血清学反应情况进一步分为若干亚型。目前，已从水禽中分离到了16种HA与9种NA亚型的A型流感病毒。家禽感染AIV后，表现为高致病力，中度致病力，低致病力和无致病力。禽流感病毒H5N1、H5N2、H9N2、H7N7、H10N7以及H10N8等均有感染人的报道。2013年3年31日首先在中国上海和安徽发现了3例人感染H7N9禽流感病例，根据全国法定传染病疫情报告，截至2015年6月30日，全国累计人感染H7N9禽流感病例达到537例，死亡227例。H7N9亚型禽流感虽然在家禽中表现为低致病性，但是严重威胁到公共卫生的安全，对于防控该病，实施监测和早期的诊断显得尤为重要。近几年来，荧光PCR技术得到了很大的发展,已经广泛应用于动物疫病监测和诊断，为了验证应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒可行，对该方法的特异性、敏感性、重复性并采取了临床样品进行了试验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器H7N9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，批号为：2015002；H5亚型禽流感抗原（Re-6株）、H9亚型禽流感抗原：购自哈尔滨维科生物技术开发公司，批号分别为：2013004，2013002；新城疫抗原购自哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司，批号：20150116；病毒RNA提取试剂盒（离心柱法）购自中山大学达安基因股份有限公司，批号：20140724。

1.1.2 仪器与设备ABI 7500荧光PCR仪，购自美国ABI公司。

1.1.3 样品来源鸡泄殖腔、后拭子共100只采自东莞市常平镇三鸟批发市场。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取方法在1.5mL的无菌离心管内加入50μL蛋白酶K；取200μL样品加入离心管中；加入200μL已含Carrier RNA的裂解液，漩涡振荡15s充分混匀，瞬时离心，72℃，10min；加入250μL乙醇，漩涡振荡15s；将混合液全部吸至离心柱，室温下12000g离心1min，将离心柱装至新的收集管；将500μL的抑制物去除液加入离心柱，室温下12000g离心1min，将离心柱装至新的收集管；将500μL的去离子液加入离心柱，室温下12000g离心1min，将离心柱装至新的收集管；将离心柱收集管室温下14000g离心3min除去参与乙醇；将离心柱取出，放置于新的1.5mL，打开离心柱盖子，72℃放置2min；在离心柱膜的正上方加入72℃预热的洗脱液50μL，静止1min，14000g离心1min，核酸-20℃保存。

1.2.2 荧光RT-PCR方法分别配置H7和N9反应体系，每管加入反应液A 17μL，反应液B 3μL。探针检测模式设置为：ReporterDye1：FAM，QuencherDye：NONE，Passive Reference：NONE。反应条件设置为：50℃15min，1个循环；95℃15min，1个循环；94℃15s，58℃45s（收集荧光），45个循环。阴性质控无扩增曲线Undet，阳性质控有扩增曲线，Ct值小于等于32结果成立。结果判定：如果H7及N9反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值大于42判为H7N9亚型禽流感病毒阴性；如果H7及N9反应体系FAM检测通道均有扩增曲线，且Ct值小于等于42判为H7N9亚型禽流感病毒阳性；如果仅H7或N9反应体系仅其中的扩增曲线满足判为阳性，则只能判定H7亚型或N9亚型禽流感病毒阳性。

2 结果

2.1 H7 N9 亚型禽流感抗原检测结果以10-2～10-11各稀释度H7N9禽流感抗原为模板，用离心柱法提取方法提取核酸，然后用同一试剂盒方法同时上机检测，检测结果为H7能检测出1：10-10抗原稀释度，N9能检测1：10-9抗原稀释度，详细结果见表1。

表1 不同稀释度H7N9亚型禽流感荧光RT-PCR检测结果

2.2 特异性试验检测结果分别用H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原强1：1000稀释，用离心柱法提取方法提取核酸，用同一试剂盒方法同时上机检测，结果为阳性质控、临界阳性质控和阴性质控成立，H7N9亚型禽流感抗原H7反应体系CT值为19.01，N9反应体系CT值为20.22，H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原的H7和N9体系检测结果均为阴性。

2.3 重复性试验用离心柱法3次平行提取病毒RNA为模板，同时用同种试剂进行检测,对其重复性进行分析，变异系数（CV）为1.13%,重复性良好。

2.4 临床样品检测结果检测100份鸡泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。

3 讨论

H7N9亚型禽流感病毒是一种新型重组的A型流感病毒，2013年2月在中国华东地区首发并呈高度散发状态,虽然对家禽无症状或低致病性，但对公共卫生构成了严重的威胁。由于此病对家禽无症状或低致病性，所以应用快速的实验室检测方法，对该病进行监测显得尤为重要。荧光PCR技术作为一种快速、准确、特异方法已广泛用于动物疫病监测和发生动物疫情时的早期诊断该方法操作简便，从核酸提取到出结果仅需3h，荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，荧光PCR技术由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性,又可进一步提高灵敏度；荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理,避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。根据试验结果，应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原，H7体系可以检测到1：10-10抗原稀释度，N9体系能检测到1：10-9抗原稀释度，且对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应，重复性试验变异系数为1.13%，证明该方法敏感度比较高，特异性好，重复性好，适合大规模的动物疫病监测。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.027