青海湖盐单胞菌Ectoine合成基因簇ectABC的重组共表达

朱德锐 韩 睿 沈国平 龙启福 李丹丹 刘 建 刘德立



青海湖盐单胞菌Ectoine合成基因簇的重组共表达

朱德锐1, 2韩 睿3沈国平2龙启福2李丹丹1刘 建1刘德立1

(1. 华中师范大学生命科学院湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室, 武汉 430079; 2. 青海大学医学院基础医学研究中心, 西宁 810016; 3. 青海大学农林科学院, 西宁 810016)

盐单胞菌属()通过胞内积聚有机相容溶质(Compatible solutes)来抵抗胞外的高盐渗透压。为了探究相容溶质Ectoine合成代谢相关基因的结构特征和异源共表达的可能性, 以青海湖盐单胞菌sp. QHL1为材料, 通过高效液相色谱(HPLC)分析不同盐梯度下QHL1胞内Ectoine的积聚量, 并借助于染色体步移技术(Genome walking)捕获QHL1菌株的Ectoine生物合成基因簇, 利用分子克隆技术分析基因簇的异源重组表达(BL21)。研究结果表明: 胞内Ectoine的积聚量随着培养基中Na+浓度的增加而增加, 最大积聚量为167.1 mg/g细胞干重(1.0 mol/L Na+), 但菌体生长却受到高浓度Na+的强烈抑制作用。QHL1的操纵子全长序列为3580 bp, 结构基因(579 bp)、(1269 bp)与(390 bp)串联排列。基于生物信息学预测分析, 两个启动子(δ70与δ38因子控制)和若干未知功能的保守模序(Motifs)存在于QHL1的操纵子上游。构建重组表达载体pET-28-, 并在BL21中异源表达基因簇(2438 bp)。SDS-PAGE结果显示EctA、EctB和EctC分别为27.2、52.5 和 20.8 kD, 与预测结果一致, 表明、和基因能在BL21中实现异源共表达, 为构建Ectoine合成代谢基因整合的系统代谢工程, 并实现低盐发酵控制和过量化生产提供了重要的理论基础。

盐单胞菌属; Ectoine;基因簇; 结构基因; 共表达

盐单胞菌属()是中度嗜盐菌的重要代表菌群, 革兰阴性、需氧、杆状, 多分布于盐湖、盐场、海洋或海洋极端环境之中。通常, 盐单胞菌属采用吸收转运和生物合成相容溶质的策略(Compatible solute strategy)来平衡高盐渗透压[1]。相容溶质Ectoine是一类具有亲水性和两性离子特征的有机小分子, 可视为氨基酸的环化衍生物或部分氢化的嘧啶衍生物, 广泛存在于嗜盐或耐盐菌胞内。细胞中大量积聚, 可抵抗高渗透压的冲击, 亦可作为生物大分子和整个细胞的稳定剂以及压力保护剂, 有助于细胞抵抗冷冻、高温高压、高盐干旱、酸碱辐射等各种逆境因素的影响[1, 2]。

经过二十多年的研究, Ectoine合成途径的研究在基因水平、酶水平和调控水平上已较为深入。作为Ectoine生物合成研究的模式种群, 最早报道了延长盐单胞菌株DSM 2581与DSM 3043的合成代谢途径[1]。截止到目前, Ectoine合成基因簇已在海球菌属()、芽胞杆菌属()、喜盐芽胞杆菌属()、假单胞菌属()、涅斯捷连科氏菌属()、链霉菌属()、普劳塞氏菌属()枝芽胞菌属()、甲基盒菌属()、色盐杆菌属()、甲基微菌属()等[3—13]属种中被成功克隆。在上述Ectoine的合成代谢途径中, 以L-lysine生物合成途径中的天冬氨酸半醛(L-aspartate-β-semialdehyde)为前体, 依赖于进化高度保守的连锁或-基因簇操纵子, 结构基因、和分别编码L-二氨基丁酸转氨酶(EctB)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)和四氢嘧啶合酶(EctC)联合作用合成Ectoine[3—13]。此外, 基因编码四氢嘧啶羟化酶(EctD), 可将Ectoine转化为Hydroxyectoine[11,13]。

在生物医学行业中, Ectoine可提高皮肤的再生能力、延缓其老化和抑制黑色素的生成, 可作为安全的化妆品保湿剂与增白剂[14]。随着Ectoine在生物医药行业的广泛应用和巨大的商业需求, 导致各个研究机构努力改善和提高细菌的Ectoine生产能力。尽管许多细菌能合成Ectoine, 但在合成能力、合成途径的进化和组织方式上, 存在着较大的差异。为此, 本研究以青海湖盐单胞菌株sp. QHL1为材料, 分析不同盐梯度下QHL1胞内的Ectoine积聚量, 并探究Ectoine合成代谢相关基因的结构特征和实现了基因簇的异源共表达, 为后期构建系统代谢工程菌和工业应用奠定了重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与培养基

野生嗜盐菌株sp. QHL1分离来源于青海湖。菌株DH5a与BL21 (DE3)由本实验室保存, 克隆载体pMD18-T购于TaKaRa公司, 表达载体选取质粒pET-28a(+)。OSM培养基(g/L)[7]: NaCl可调, MgSO49.7 g, 柠檬酸钠 3.0 g, KCl 2.0 g, CaCl20.2 g, 细菌蛋白胨10.0 g, 酵母抽提物2.0 g,调节pH为7.5。细菌LB液体培养基(g/L): 胰蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, NaCl 10.0 g, 用1 mol/L NaOH调pH至7.0。固体培养基加琼脂15.0 g, 1×105Pa灭菌15min。

1.2 主要试剂与仪器

Ectoine 标准品, HPLC级≥95%购自德国Fluka Analytical公司; 色谱级甲醇与乙腈购自天津康科德公司; 针筒式膜过滤器, 水系(0.45 µm), 购自上海德里安公司; 细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒和质粒提取试剂盒分别来自上海赛百盛公司、爱思进生物公司和北京博大泰恒公司; 引物由上海捷瑞生物公司合成;DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶以及 Genome walking Kit (D316)均购自TaKaRa公司; 氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)与IPTG购自北京鼎国昌盛公司; HPLC仪(Aligent Technologies 1200 Series, USA); Eclipse XDB-C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI上公开的sp. NJ223 (Accession No. DQ886907)、sp. TNB I20 (AB119507)和sp. BYS-1(DQ017757)的基因序列, 设计合成了基因保守区段的简并引物(CSF与CSR), 见表1。根据已知的QHL1基因保守区段测序结果, 设计染色体步移扩增上游和下游序列的引物(SPF1/2/3与SPR1/2/3), 用于巢式PCR扩增基因保守区的侧翼序列。根据测序获得的QHL1 Ectoine合成基因簇, 设计基因簇PCR扩增的上、下游引物(R与F)。引物设计采用Primer 5.0软件设计, 由上海捷瑞生物有限公司合成。

表1 本实验中使用的引物序列

注: 下划线为限制性内切酶位点; 简并碱基突出显示, 如Y(C/T), K (G/T), M (A/C), R (A/G)

Note: The base sequences underlined are the restriction sites. The highlighted base corresponds to degenerate bases as follows: Y (C/T), K (G/T), M (A/C), R (A/G)

1.4 盐梯度诱导培养

菌株活化: 将QHL1菌株接种于4 mL OSM低盐培养基, 120 r/min, 37℃恒温振荡培养12h活化, 至600值达1.20左右, 批量接种备用。NaCl诱导实验: 设置不同NaCl浓度梯度(0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mol/L)的OSM培养液(pH7.5), 150 mL培养体系, 1%接种量接种, 150 r/min、37℃恒温振荡培养12h后取出。测定600值。50 mL发酵液测其干重, 50 mL发酵液抽提Ectoine。细胞干重(Cellular dry weight)的测定: 取发酵液, 4℃、12000 r/min 离心 15min, 菌体用含有等渗缓冲溶液(NaCl浓度与培养基浓度相同)洗涤, 离心后沉淀 90℃烘干至恒重, 称量。

1.5 HPLC检测Ectoine

细菌胞内Ectoine的抽提采用乙醇抽提法[15]。Ectoine标准曲线的绘制: 配制含有2.5 mg/mL的Ectoine标准品母液, 倍比稀释梯度浓度, 备用检测。采用高效液相色谱检测, 采用外标法计算谱图的峰面积, 制作标准曲线。Ectoine检测波长是(200—215) nm, 流动相采用乙腈/超纯水(/, 80/20), Eclipse XDB- C18柱, 150 mm×4.6 mm, 柱温20℃, 压强400 bar, 进样量10 µL, 流速1.0 mL/min, 运行时间8min[16]。

1.6 基因保守区的PCR扩增

总DNA提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。以QHL1的基因组DNA为模板, 进行PCR扩增。反应体系(50mL): 模板DNA(约250 ng) 1mL; 引物-CSR (10 nmol/L) 1mL; 引物-CSF (10 nmol/L) 1mL; 10×PCR缓冲液 5mL; Mg2+(25 mmol/L): 7mL; dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 1mL;聚合酶(1.25 U/mL) 1mL; 去离子H2O 33mL。PCR扩增条件: 95℃预变性5min; 95℃变性40s, 58℃退火40s, 72℃延伸60s, 30个循环, 最后72℃延伸10min。以琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化PCR产物, 克隆至pMD18-T, 转化DH5a, 酶切鉴定阳性克隆, 并由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.7 扩增基因的侧翼序列与基因簇结构分析

根据测序得到的基因序列, 分别设计了扩增基因上游和下游序列的特异性引物各3条(SPF1/2/3与SPR1/2/3 Primer, 见表1), 用于染色体步移, 具体原理及操作步骤见试剂盒TaKaRa Genome walking Kit (D316)。反应体系: 基因组DNA 1 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L ) 8 μL, 10×LA PCR Buffer (Mg2+plus) 5 μL, LA酶 (5 U/μL) 0.5 μL, SP引物1 μL, AP引物1 μL, 加灭菌去离子水至50 μL。取第1轮、第2轮、第3轮 PCR反应液各5mL进行1% (/)的琼脂糖凝胶电泳检测。以琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化第3轮PCR特异性产物, 连接pMD18-T后, 转化至DH5a菌株, 酶切鉴定阳性克隆, 并进行DNA测序。通过DNAman软件对克隆得到的基因簇序列与GenBank中选取的邻近序列进行核酸和氨基酸序列同源性分析, 并利用DNAstar软件进行ORF (Open reading frame)分析, 在线软件(http: //www.fruitfly.org/seq_tools/promoter. html)预测分析启动子。

1.8 基因簇的克隆表达分析

以QHL1的基因组DNA为模板, PCR扩增基因簇。PCR产物纯化后克隆至pMD18-T, 通过TA互补连接后转化DH5a, 酶切鉴定阳性克隆。H I和I双酶切pMD18T-, 并亚克隆到表达载体pET-28a, 构建重组表达载体pET-28-, 转化BL21(DE3)并筛选阳性克隆子, 测序分析。基因的诱导表达与SDS-PAGE具体方法参考《精编分子生物学实验指南》进行[17]。将鉴定正确的阳性重组菌接种于含Kan (50mg/mL)的LB培养基中, 37℃、150 r/min培养至对数期(600约为0.6), 加入1 mmol/L IPTG, 37℃诱导培养24h, 间隔2h取样。在相同条件下, 以不诱导的含表达载体的宿主菌作为对照。诱导培养的菌液8000 r/min、10min离心收集沉淀, 重悬于1×SDS凝胶加样缓冲液中, 煮沸10min, 8000 r/min离心2min, 取上清进行SDS-PAGE分析[18]。

1.9 重组工程菌的耐盐测试

通过OSM培养基, 培养重组工程菌BL21 (pET-28-), 以未重组的菌株BL21为参照, 检测其耐盐能力。盐梯度设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/L NaCl, 按1%接种量接种, 150 r/min、37℃恒温振荡培养12h, 测定600值。

2 结果

2.1 盐单胞菌QHL1的Ectoine生物合成特性

嗜盐菌sp. QHL1的生长盐度范围为(0.04—2.74) mol/L NaCl, 最适生长盐度为0.86 mol/L NaCl, 隶属中度嗜盐菌。通过乙醇法抽提菌株QHL1的胞内Ectoine, 并进行HPLC定量分析。Ectoine属于亲水性、兼性离子的氨基酸环化衍生物, 因此HPLC分析时极易分离, 出峰时间短。通过比对分析QHL1菌株胞内抽提物与Ectoine 的标准图谱(39.06 µg/mL) (图1), 结果显示QHL1菌株的细胞抽提物(1.0 mol/L NaCl)出峰时间为1.189—1.195min, 峰形特征和出峰时间与标准品基本一致, 说明QHL1菌株胞内含有相容溶质Ectoine, 亦预示着QHL1菌株内存在有Ectoine生物合成的基因簇。

A. HPLC检测标准品Ectoine (39.06 μg/mL); B. HPLC检测QHL1菌株胞内抽提物, 采用改良的OSM培养基培养QHL1菌株, 培养盐度1.0 mol/L NaCl

A. The spectra of authentic ectoine by HPLC (39.06 μg/mL); B. The map of intracellular ectoine extracted from strain QHL1 by HPLC. QHL1 was cultivated at 1.0 mol/L of NaCl in the improved Oesterhelt-Stoeckenius medium

设置不同 Na+浓度梯度的OSM培养基, 在生长优化条件下培养QHL1, 采用HPLC测定其菌体提取物中的Ectoine含量。以Ectoine质量浓度(mg/L)和600为纵坐标, Na+浓度(mol/L)为横坐标, 绘制Ectoine浓度-离子浓度关系曲线图, 如图2所示。分析表明: 低浓度的Na+(≤1.0 mol/L)对QHL1菌株的生长没有明显的影响, 而当Na+浓度高于1.0 mol/L以后, 菌体生长量明显受到强烈的抑制作用; 胞内Ectoine的积聚量严格受到Na+的影响作用, 极低浓度的Na+(0.25 mol/L)没有刺激Ectoine的大量积聚, 但当盐度从0.25 mol/L增加至1.0 mol/L时, Ectoine的积聚量维持较高的水平, 至1.0 mol/L时可高达121.14 mg/L (12h), 此时Ectoine的细胞干重比亦最大(167.1 mg/g CDW), 此后随Na+浓度的增加而减少, 菌体生长明显受到抑制, 由此表明Ectoine积聚量主要依赖Na+存在, 但又受到高浓度Na+对其生长的强烈抑制作用。

细胞干重: Cellular dry weight (CDW, mg/g)

2.2 盐单胞菌QHL1基因簇的克隆

Ectoine的合成途径依赖于进化高度保守的或或-基因簇, 在染色体上连锁构成操纵子(图3A), 结构基因中以基因最为保守, 其中盐单胞菌属的相似度>84%。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取QHL1的总DNA。以基因组DNA为模板, 采用简并引物(表1)进行基因保守序列的PCR扩增。PCR产物纯化回收后, 连接至克隆载体pMD18-T, 转化DH5a, 提取质粒进行酶切鉴定分析, 阳性克隆子测序, 获得基因保守序列977 bp。利用上游引物SPR1/SPR2/SPR3与下游引物SPF1/SPF2/ SPF3 (表1), 通过染色体步移扩增基因保守区段的上游和下游序列(图3B)。经三轮巢式PCR扩增基因上游序列, 获得上游序列约1500 bp, 下游序列约1200 bp。将上、下游巢式PCR扩增产物纯化, 克隆至pMD18-T载体, 并转化至DH5a菌株, 酶切鉴定分析并测序。

经过染色体步移扩增基因上下游序列, 测序比对拼接3580 bp。DNAStar软件分析表明: 结构基因与串联排列;与间隔109 bp,与间隔91 bp;上游调控序列635 bp, 应全部含盖启动系列元件和操纵子元件。QHL1的基因长度为579 bp, 编码192个氨基酸的肽链, 预测pI为4.78, 与的基因相似性为74%—80%, 与EctA蛋白相似性为58%—98%, GenBank Accession No. JX312790; 基因长度为1269 bp, 编码422个氨基酸的肽链, 预测pI为5.98, 与的基因相似性为78%—91%, 与EctB蛋白相似性为85%—98%, GeneBank Accession No. JX312791; 基因长度为390 bp, 编码129个氨基酸的肽链, 预测pI为5.30, 与的基因相似性为72%— 96%, 与EctC蛋白相似性为75%—96%, GenBank Accession No. JX312792。

A.DSM 2581T菌株基因簇的结构与组成; B. 巢式PCR扩增保守序列策略; 中心实线区域为977 bp的基因保守序列; 引物AP1/2/3/4来自Genome Walking Kit D316

A. The gene composition and organization of the-cluster inDSM 2581T; B. Strategy of amplification of the flanking sequence by nested PCR. Solid lines in the center represent 977 bp known conservative sequence of. Primers AP1/2/3/4 were provided by the Genome Walking Kit D316

2.3 启动子预测比对和操纵子的结构分析

通过采用在线软件伯克利大学Neural Network Promoter Prediction (http://fruitfly.org.9005/seq-tools/ promoter.html)预测分析基因上游序列中的启动子。根据预测结果和结构基因位置, 初步认定sp. QHL1基因上游序列28 bp处应为转录起始位点(+1), 典型的保守特征有: 转录起始位点(TSS, 以A为起始点)、–10区序列(TATAAT)、–35区序列(TTGAAT)以及–10区和–35区序列的间隔距离(17 bp), 此与的δ70启动子序列核心区域保守模式一致。与基因上游的间隔序列, 未发现具有明显特征的启动子序列, 初步认定串联排列的基因簇是一个转录单元。

利用MEGA 4.0比对分析sp. NJ223 (GeneBank Accession No. DQ886907)、sp. BYS-1(DQ017757)、延长盐单胞菌.DSM 2581 (FN869568)和DSM 3043(AJ011103)的基因的上游序列, 确定其可能的启动子序列及位置(图2)。比对结果显示:的代表性菌株中可能普遍存在两个启动子, 即δ70因子控制启动子与δ38因子控制启动子, 与已有报道一致[19—20]。通常, 典型的δ70因子控制启动子具有–10区与–35区间隔序列为17 bp的特征。在QHL1菌株中, δ70因子控制启动子的–10区与–35区(TTGAAT [17nt] TATAAT)结构类似于的δ70因子控制启动子。δ38因子控制启动子(渗透压调控)位于基因上游约91 bp处, –10区与–35区分别为保守的CATAAC序列与GCCGC序列(G-elements)。此外, 若干保守的、未知功能的Motifs存在于基因的上游, 诸如: 在转录起始点(+1)与核糖体结合位点(RBS)之间存在7 nt的AATTCGC序列; 紧邻Pribnow box (–10)处存在5 nt的GCTGT序列; 在–35区的两侧翼分别存在5 nt的CATAA序列和6 nt的AATAAT序列。

A. 基于MEGA 4.0软件比对分析ectA基因上游启动子序列. 1为本研究中的QHL1上游序列; 2为sp. NJ223; 3为sp. BYS-1; 4为DSM2581; 5为DSM3043. RBS代表核糖体结合位点; 箭头为转录起始位点(+1); B. QHL1菌株基因簇启动子与终止子的结构特征与组成

A. The upstreampromoter region was shown based on the sequence alignment by MEGA4.0 software. 1. QHL1 in this study; 2.sp. NJ223; 3.sp. BYS-1; 4.DSM2581; 5.DSM3043. RBS: ribosome-binding site, and arrows indicated the transcription initiation sites (+1); B. Putative structural features of the promoter and terminator was predicted ingenes cluster of QHL1

2.4 基因簇的克隆表达分析

以QHL1的基因组DNA为模板, 利用引物(-F/-R)进行基因簇的PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳可见特异性的目的条带, 其分子量大小与预期结果一致, 表明成功克隆基因簇。PCR产物纯化回收, 克隆至pMD18-T, 转化DH5a, 酶切鉴定阳性克隆并测序, 目的基因簇为2438 bp。将基因簇的PCR扩增产物亚克隆至表达载体pET-28a, 构建重组表达载体pET-28a-。经H I和I酶切分析, 目的条带约2500 bp, 与预期的结果一致。经测序验证, 结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确, 未发生错配及移码。将重组表达载体pET-28-转化至BL21(DE3)中, 成功构建重组菌株。

在BL21中, 采用IPTG(1 mmol/L, 37℃)诱导, 异源表达基因簇(图5)。SDS-PAGE结果显示EctA、EctB和EctC分别为27.2、52.5和20.8 kD, 与预测结果一致, 表明、和基因能在BL21中实现异源表达, 且基因簇能同时翻译表达, 但的表达量略小于和基因的表达量, 可能因为受到宿主BL21的蛋白水解酶降解, 亦或受到和基因转录后的抑制作用[19]。

M为标准蛋白质Marker; N为未诱导的重组菌株; 泳道2、4、6、8、12与24分别代表不同的诱导时间(h);重组菌株BL21/ pET-28a-在T7强启动子诱导表达, 表达产物EctA, EctB与EctC均为单体酶蛋白

M. protein marker. N: recombination strain not induced. Number 2, 4, 6, 8, 12 and 24. different induction time (h). Recombinant strainBL21(pET-28a-) was inducted and expressed with a strong promoter T7, and expression products EctA, EctB and EctC were monomer enzyme proteins

2.5 重组菌株BL21/pET-28a-的耐盐适应性

设置不同盐浓度梯度(0—1.2 mol/L NaCl)的OSM培养基, 检测基因簇是否影响BL21和重组菌株的生长量, 结果显示:BL21能生长的盐度范围为(0—0.8) mol/L NaCl; 而BL21 (pET-28a-)能耐受的盐度为1.0 mol/L NaCl, 且生长量要略大于其对照菌株(图6)。由此, 表明重组菌株在盐度耐受上, 要优于未重组菌株, 能抵抗一定的渗透压冲击。

3 讨论

本研究采用HPLC定量分析sp. QHL1菌株胞内Ectoine的积聚情况, 结果表明QHL1菌株胞内可积聚单一组分的Ectione。当培养基的Na+浓度为(0.25—1.0) mol/L时, Ectoine的积聚量随盐度的升高而逐渐增大; 当Na+浓度为1.0 mol/L时, Ectoine的细胞干重比最大(167.1 mg/g CDW, 12h); 此后随Na+浓度的增加而减少, 菌体生长明显受到抑制, 由此表明: 在环境渗透压胁迫下, 培养基中的Na+浓度对Ectoine的合成具有重要的影响。在一定的NaCl浓度范围内, Ectoine的合成量随培养基中Na+浓度的升高而增加, 但是高浓度的Na+亦能降低细胞生长速度和生物量[1]。

生长量的检测通过测定600值, 培养时间12h (37℃); 误差分析表示为平均值±标准方程(=3),＜0.05

The growth rate was checked by measuring the600after 12h incubation at 37℃. Error bars were expressed as means±standard deviation (=3). Statistical significance was set at<0.05

利用染色体步移技术, 本研究克隆获得QHL1菌株的Etoine生物合成基因簇。目前, NCBI数据库中有关盐单胞菌属不同菌株的基因簇全序列的提交数据相对较少。本研究共收集获得7株盐单胞菌属菌株的基因簇全序列, 如sp. NJ223 (DQ886907)、sp. BYS-1(DQ017757)、DSM 3043(AJ011103)、DSM 2581(FN869568)、(D88359)、(AF031489)以及原隶属盐单胞菌属的DSM 3043(NC007963), 且以延长盐单胞菌居多。基于多序列分析, 部分菌株的基因簇全序列数据完全相同。截止目前, 在NCBI数据库中, 盐单胞菌属实际上仅有5株菌株有效的基因簇全序列数据(包括本研究中的QHL1)。

基因组中完整的基因簇序列广泛存在于嗜盐细菌与耐盐细菌之中。在30株革兰阴性细菌中, 基因簇与天冬氨酸激酶基因, 采用-串联的操纵子模式; 而在革兰阳性细菌中, 仅以操纵子模式存在[19]。目前, 典型操纵子模式有以下几种[20]: (1) 在延长盐单胞菌、需盐色盐杆菌s、泊库岛食烷菌、克劳氏芽胞杆菌与之中, 结构基因、与串联形成操纵子; (2) 在菌株耐盐芽胞杆菌、鲁杰氏菌sp. TM1040以及所有的弧菌属()种成员之中, 由基因簇与基因形成-操纵子; (3) 在海洋泉古菌、海洋芽螺旋菌、天蓝色链霉菌A3及β-变形纲成员之中, 则以操纵子存在; (4) 在阿拉斯加鞘氨醇单胞菌、海单胞菌sp. MWYL1与施氏假单胞菌A1501等菌株之中,基因簇与基因形成-操纵子。在本研究中,sp. QHL1的操纵子隶属上述第一种类型, 属于操纵子, 其内部结构具有δ70因子控制启动子与δ38因子控制启动子, 此与先前的报道一致[20]。

本研究成功构建了重组菌株BL21/pET- 28a(+)-, 经1 mmol/L IPTG的诱导后, SDS- PAGE结果分析表明: EctA, EctB和EctC分别为27.2、52.5和20.8 kD, 与预测结果一致, 表明、、基因能在BL21中实现异源共表达, 且重组菌株在耐盐能力上有明显提高。在Ectoine合成代谢相关基因的克隆表达与代谢工程菌构建方面[21], 诸多研究已取得系列技术上的突破,为后期工业应用提供了重要的技术思路。早期Zhao等[5]、Reshetniko等[6]、Zhang等[7]、Rajan等[10]和Bestvater等[22]分别从达坂喜盐芽胞杆菌D-8T、嗜碱产甲烷菌20Z、耐盐芽胞杆菌、正喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 20541和嗜盐海球菌中克隆了+基因簇, 实现了异源表达; Seip等[13]和Stöveken等[23]分别从施氏假单胞菌DSM 5190T和A1501菌株中, 克隆了基因簇并实现了异源表达, 且Ectoine/Hydroxyectoine的产量高于以基因簇构建的工程菌; Eilert等[24]和Moya等[25]采用系统整合的方法, 分别将延长盐单胞菌ATCC33173与需盐色盐杆菌的基因簇重组整合至多形汉逊酵母和DH5α菌株, 实现Hyd­roxyectoine的过量化生产; Becker等[26]基于系统代谢工程, 成功将A1501菌株的基因簇, 系统整合至谷氨酸棒杆菌, 实现了Ectoine的过量化生产。本研究以青海湖盐单胞菌株sp. QHL1为材料, 分析不同的盐梯度下QHL1胞内的Ectoine积聚量, 并探究Ectoine合成代谢相关基因的结构特征和实现了基因簇的异源共表达, 为后续构建Ectoine合成代谢相关基因系统代谢工程菌株、实现低盐发酵控制和大规模应用开发奠定基础。

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RECOMBINANT CO-EXPRESSION OF THE ECTOINE BIOSYNTHESIS GENE CLUSTERINFROMQINGHAI LAKE

ZHU De-Rui1, 2, HAN Rui3, SHEN Guo-Ping2, LONG Qi-Fu2, LI Dan-Dan1, LIU Jian1and LIU De-Li1

(1.Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, School of Life Science, Central China Normal University, Wuhan430079, China; 2.Research Center of Basic Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, China; 3. Qinghai Academy of Agricultural Forestry Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, China)

is capable of synthesizing organic compatible solutes ectoine in response to high osmotic pressure. To reveal the possibility of heterologous co-expression of ectoine biosynthesis genes, intracellular ectoine insp. QHL1 strain was determined by HPLC under different salt gradients. The entiregene cluster for ectoine synthesis was cloned using genome walking and expressed in the heterologous recombinantBL21. The results showed that the concentration of ectoine accumulated in the cells had a positive correlation with the extracellular Na+concentration and reached a maximumvalue (167.1 mg/g cell dry weight) at 1.0 mol/L Na+, and high concentration of Na+strongly inhibited the bacteria growth. The entiregene cluster in QHL1 strain was 3580 bp, containing structural gene(579 bp),(1269 bp) and(390 bp). Based on bioinformatics prediction analysis, two putative promoters (δ70and δ38-controlled promoter) and several conserved motifs with unknown function were identified in the upstreamof-operon. The recombinant plasmid pET-28a (+)-was successfully constructed, and the results of heterologous expression indicated that these three genes could be simultaneously translated to protein EctA (27.2 kD), EctB (52.5 kD) and EctC (20.8 kD). These results contribute further improvements in ectoine high yield and hypohaline biotechnological process optimization, and also provided a framework for future genetic manipulation of systems metabolic engineering.

; Ectoine; Gene cluster; Structural gene; Co-expression

10.7541/2015.47

Q933

A

1000-3207(2015)02-0358-10

2014-04-09;

2014-06-15

国家自然科学基金(No.31060013); 青海省基础研究计划项目(No.2013Z725)资助

朱德锐(1979—), 男, 湖北鹤峰人; 博士; 主要研究方向极端盐湖环境微生物。E-mail: zhuderui2005@126.com

刘德立(1959—), 男, 湖北荆门人; 教授, 博士生导师; 主要研究方向环境微生物与分子生物学。Tel: +86-027-67867221; E-mail: deliliu2013@163.com