己烯雌酚抑制斑马鱼精子发生及其可能的分子机制

谭 号 李英文 尹 盼 刘智皓



己烯雌酚抑制斑马鱼精子发生及其可能的分子机制

谭 号 李英文 尹 盼 刘智皓

(重庆师范大学生命科学学院, 重庆市高校生物活性物质工程研究中心, 重庆市高校动物生物学重点实验室, 重庆 401331)

为研究内分泌干扰物己烯雌酚(DES)对鱼类精巢发育和配子发生的影响, 研究用DES(0.1、1和10 µg/L, 暴露20d)对内分泌干扰研究的经典模式动物——斑马鱼()雄性成鱼进行了处理。组织学研究结果表明, DES严重影响斑马鱼精子发生。同时, 研究克隆了斑马鱼与生殖细胞发育和减数分裂相关的、1的部分cDNA, 对其组织和细胞表达模式进行了研究。结果表明,仅表达于精巢的精原细胞、初级精母细胞和卵巢不同时期的生殖细胞; 而1则表达于精巢精母细胞和卵巢卵母细胞发育早期。半定量PCR结果表明, DES处理后的表达没有明显变化; 而1的表达则被明显抑制, 且呈时间依赖性和剂量依赖性效应; 而转录因子1和雄激素合成关键酶基因450 11的表达也被显著抑制。因此本研究推测, DES可能通过抑制1和450 11的表达诱导了斑马鱼生殖细胞凋亡; 并通过抑制1的表达阻碍了减数分裂。

己烯雌酚; 斑马鱼; 生殖细胞丢失; 精子发生; 减数分裂

内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指可干扰动物体内保持自身平衡、调节发育过程的内源激素的合成、分泌、运输、结合和代谢等过程的外源性化学物质[1]。EDCs广泛存在于环境中, 主要以环境雌激素为主, 部分EDCs能通过生物富集[2], 严重损害雌雄性动物的性腺发育和配子发生, 引起动物产生明显的雌、雄性化效应[3—5]。由于大多数EDCs最终汇聚于水中, 对终身生活在水中的鱼类其生殖、神经和免疫等系统的功能影响极大, 能导致其生殖能力低下、配子数量减少、性腺变小, 甚至发生性反转[ 6—8]。

据调查, 2012年在我国主要的六大江系中均不同程度存在EDCs的污染[9], 且持续恶化[10]。其中, 己烯雌酚(DES, Diethylstilbestrol), 一种医用人工合成雌激素, 是长江水系典型的EDCs之一, 主要分布在长江中下游, 浓度高达2.07—2.52 ng/L[10]。哺乳类的研究发现, DES可导致仓鼠()和大鼠()精巢发育障碍、生殖细胞凋亡[11—13]。然而, DES对鱼类精巢发育和精子发生影响的研究较少, 大多研究集中在对胚胎的影响14]。

本研究用DES(0.1、1和10 µg/L)对内分泌干扰研究的经典模式动物——斑马鱼(rerio)雄性成鱼进行了20d处理, 通过组织学的方法研究了DES对斑马鱼精巢发育和精子发生的影响。同时, 为深入研究其可能的分子机理, 本研究采用RT-PCR的方法, 在斑马鱼克隆了与生殖细胞和减数分裂密切相关的标记基因和1的部分cDNA, 并通过RT-PCR和原位杂交的方法, 研究了上述基因的组织、细胞表达模式及DES对上述基因表达的影响。另外, 本研究还检测了DES对雄性性别决定基因1和鱼类雄激素合成关键酶基因450 11表达的影响, 以期探讨DES影响斑马鱼精子发生可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和仪器

DES, 购自美国Sigma公司; 总RNA提取试剂盒(Trizol), 购于Invitrogen公司; 逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit), 型号: RR047A, 购于日本TaKaRa公司。其余试剂为国产分析纯。DM2700 M光学显微镜, 德国徕卡公司; PCR仪, 型号: My cycler, 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验材料

实验用斑马鱼雄性成鱼(AB系4月龄)为研究组自行繁殖获得, 平均体重(0.42±0.04) g, 处理前用曝气除氯后的自来水暂养于的恒温循环水养殖系统中。

1.3 实验设计

设置3个实验剂量组(0.1、1和10 µg/L, 0.05‰ DMSO作为助溶剂), 对照组为0.05‰ DMSO。处理实验在30 L的玻璃缸中进行, 每缸随机放入实验鱼50尾; 每天喂食3次, 持续增氧, 每天换水1次, 处理20d。水体温度控制在(28 ± 1)℃, 光照周期为14h︰10h (光暗比)。在处理后3、6、12和20d, 每组各解剖3尾鱼的精巢, 液氮速冻后, 于–80℃备用。处理后20d, 每组各取3尾鱼精巢, 波恩氏液固定、包埋, 常规石蜡切片。上述实验共重复3次。

1.4 组织学研究

将斑马鱼置于冰面上, 麻醉后解剖出斑马鱼精巢, 于波恩氏液固定24h。将材料依次放入梯度乙醇和二甲苯中脱水、透明, 并在60℃包埋。随后进行常规组织学切片(厚度5 µm)和苏木精/伊红(HE)染色, 中性树胶封片后拍照。

1.5 斑马鱼和1部分cDNA的克隆

解剖斑马鱼雌雄性腺, 用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。测定浓度后, 取1 µg总RNA按照Prime­- Script RT reagent Kit (TaKaRa)说明书合成第一链cDNA。

根据GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公布的斑马鱼(BC129275)1(NM_001020782) mRNA序列, 设计基因特异性引物, 并利用已合成的第一链cDNA在PCR扩增仪(Bio-Rad IQ5)上扩增部分序列。其扩增条件为: 为94℃ 3min, 35个循环的94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min。扩增片段在1% 的琼脂糖凝胶上电泳, 溴化乙锭(EB)染色后, 在凝胶成像系统上分析。目的片段用胶回收试剂盒(Geneview)纯化后亚克隆入pMD19-T载体(TaKaRa), 挑选阳性菌落, 提取质粒, 测序。本实验所用引物见表1。

表1 引物序列

1.6 斑马鱼和1mRNA在各组织中的分布

解剖斑马鱼雌雄各组织(T. 精巢、O. 卵巢、B. 脑、L. 肝脏、I. 肠、K. 肾脏、H. 心脏、M. 肌肉、Sp. 脾脏), 提取总RNA, 按照PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa)说明书合成第一链cDNA。用和1基因特异性引物研究其在斑马鱼各组织中的表达模式, 并以1作为内参, 以质粒和蒸馏水为模板扩增的产物分别作为阳性和阴性对照。其扩增条件为: 为94℃ 3min, 28个循环的94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳, EB染色后在凝胶成像系统上进行拍照、分析。

1.7 斑马鱼和1 mRNA在细胞中的表达

斑马鱼和1的反义链和正义链(阴性对照)cRNA探针利用线性化的质粒, 参照地高辛标记试剂盒(Roche, Germany)说明书进行体外转录。

解剖出斑马鱼成鱼雌雄性腺, 在4% PFA中, 4℃固定16h。随后在乙醇(DEPC)和二甲苯中脱水、透明, 并在60℃包埋。石蜡组织切片经常规二甲苯脱蜡、梯度酒精复水和0.85×PBS润洗后, 用蛋白酶K于37℃消化12min, 随后经4% PFA重新固定和0.25%乙酰酐溶液乙酰化; 切片在66%去离子甲酰胺/2×SSC预杂交液中60℃预杂交1h, 随后分别加入地高辛标记的和1探针, 于60℃杂交16h。杂交后经SSC缓冲液洗涤, BufferⅠ (0.1 mol/L马来酸, 0.15 mol/L NaCl, pH7.5)洗涤5min, 封闭剂Buffer Ⅱ(BufferⅠ中含1%BSA)室温封闭30min, 加入1︰2000稀释的碱性磷酸酶标记的anti-DIG-AP抗体(Roche), 室温孵育30min, Buffer I洗涤3×15min, 并用NBT和BCIP显色, 封片、拍照。

1.8 DES对斑马鱼1、1和450 11mRNA的表达量的影响

取–80℃备用的斑马鱼精巢, 提取总RNA, 合成cDNA, 用半定量RT-PCR (Semi-quantitative RT-PCR)方法检测斑马鱼1、1 (AF439562)和450 11(NM_001080204)mRNA的表达变化, 并以1作为内参, 所用引物参考表1。其扩增条件为和1: 94℃ 3min, 28个循环的94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min;1和450 11: 94℃ 3min, 28个循环的94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳, EB染色后, 用凝胶成像系统成像, 并用Quantity One(Bio-Rad)进行光密度分析。数据用9个平行样的平均值±标准误(Means±SE)表示。结果用SPSS1310软件(SPSS, Chicago, IL, USA)进行方差分析和差异比较,<0.05, 差异显著。柱形图用GraphPad Prism 5(GraphPad Software, San Diego, CA)进行绘制。

2 结果

2.1 DES对斑马鱼精巢影响的组织学观察

研究结果表明, 对照组斑马鱼精巢生精小管数量众多, 内有不同发育时期的生精小囊, 囊内的生殖细胞处于同一发育时期, 而相邻小囊内的生殖细胞处于不同发育阶段(图1A)。不同的是, 所有剂量的DES均对斑马鱼精巢发育和精子发生造成不同程度影响。在低剂量组精巢中, 体细胞增生, 细胞膨大(图1B); 在中剂量组精巢中, 处于精细胞时期的生精小囊数目减少, 单倍体生殖细胞(尤其是精子细胞)大量丢失, 出现生殖细胞丢失后产生的空腔(图1C); 而在高剂量组精巢中, 单倍体生殖细胞大部分或全部丢失, 空腔化严重, 精母细胞数量也有所减少(图1D)。

A. 对照组; B-D. DES处理组(0.1、1和10 µg/L); Sg. 精原细胞; PS. 初级精母细胞; SS. 次级精母细胞; SC. 支持细胞; St. 精子细胞; Sz. 精子; *. 生殖细胞丢失形成的空腔; 标尺: 50 μm

A. Control; B-D. DES (0.1, 1 and 10 µg/L). Sg. Spermatogonium; PS. Primary Spermatocyte; SS. Secondary Spermatocyte; SC. Sertoli cell; St. Spermatid; Sz. Spermatozoa; asterisk. cavity resulting from germ cell loss. Scale bar: 50 μm

2.2 斑马鱼和1组织表达模式的研究

组织表达模式研究表明,和1仅在斑马鱼性腺(精巢和卵巢)中表达, 不在其他非性腺组织中表达。其中,在精巢和卵巢中的表达水平相当,1在精巢中的表达略高于卵巢(图2)。

2.3 斑马鱼和1细胞表达模式的研究

原位杂交结果表明,和1仅表达于斑马鱼性腺生殖细胞中。在精巢中,仅在精原细胞和初级精母细胞中表达(图3A); 而1则表达于初级和次级精母细胞(图3C); 在卵巢中,在所有时期生殖细胞都有表达, 主要表达于卵母细胞发育早期, 发育后期卵母细胞表达丰度较低(图3B); 而1则仅表达于卵母细胞发育早期, 而在初级生长卵母细胞中没有表达(图3D)。

T. 精巢、O. 卵巢、B. 脑、L. 肝脏、I. 肠、K. 肾脏、H. 心脏、M. 肌肉、Sp. 脾脏、NC. 阴性对照、PC. 阳性对照、1为内参

T, testis; O, ovary; B, brain; L, liver; I, intestines; K, kidney; H, heart; M, muscle; Sp, spleen; NC, negative control; PC, positivecontrol;1, internal control

Testis. 精巢; Ovary. 卵巢; Sg. 精原细胞; PS. 初级精母细胞; SS. 次级精母细胞; PG. 初级生长卵母细胞; PV. 卵黄发育前期; EV. 卵黄发育早期; MV. 卵黄发育中期; 黑色箭头, 阳性信号; 黑色三角形: 阴性信号; 插图: 阴性对照

Sg. Spermatogonium; PS. Primary Spermatocyte; SS. Secondary Spermatocyte; PG. primary growth stage; PV. previtellogenic stage; EV. early vitellogenic stage; MV. midvitellogenic stage; Arrow. positive signal; arrowhead. negative signal; Inset. negative control

2.4 DES处理对斑马鱼中1、1和450 11mRNA水平的影响

半定量RT-PCR结果显示, 不同剂量的DES对斑马鱼精巢中的表达影响较小。尤其是在各取材时间点,的表达在各组间没有显著差异(图4A)。不同的是, DES能显著抑制斑马鱼精巢中1、1和450 11的表达。其中处理后6d,1的表达量开始下调, 且呈明显的时间依赖性和剂量依赖性(图4B); 处理后6d, DES(10 µg/L)显著下调1的表达, 呈明显的时间依赖性(图4C); 而DES下调450 11的表达则在处理后20d (图4D)。

大写字母, 不同时间同组结果的显著性差异(<0.05); 小写字母, 相同时间不同组结果的显著性差异(<0.05)。dat, 处理后天数。=9

Uppercase letters, significant difference in the same group of different time points (<0.05); lowercase letters, significant difference in the same time point of different groups (<0.05). dat, days after treatment.=9

3 讨论

大量研究表明, EDCs能导致雄性动物生殖细胞发育障碍, 精子数量和精液量减少等问题[15—17]。作为低等脊椎动物的鱼类, 由于其性腺发育和分化的可塑性, 对EDCs更为敏感。在分化早期暴露于EDCs则能产生间性甚至性反转[18]; 而在性腺分化结束后暴露于EDCs中, 其可能造成性腺发育障碍, 配子发生异常[19—21]。作为典型的EDCs, DES也能造成相似的结果。青鳉()和银鲫()的研究表明, 1 µg/L和10 µg/L剂量的DES能分别诱导其精巢发育障碍和生殖细胞数量减少[22, 23], 与本研究的结果极为相似。小鼠()和大鼠的研究发现, 雌二醇(E2, Estradiol)能诱导其精母细胞和精子细胞发生凋亡[24—26]。另外, 1 µg/L和10 µg/L乙炔基雌二醇(EE2, 17α-Ethiny­lestradiol)也能诱导青鳉精巢中生殖细胞凋亡[21]。由于DES的生理效应与E2和EE2极为相似, 其暴露后的斑马鱼精巢也产生了与青鳉极为相似的生理学变化, 因而推测DES诱导了斑马鱼精巢中生殖细胞发生凋亡。

为什么DES能诱导雄性斑马鱼生殖细胞凋亡呢？众所周知, 转录因子dmrt1对鱼类精子发生起重要作用[27]。尼罗罗非鱼()的研究发现, dmrt1缺陷能导致精巢畸形, 精原细胞退化, 甚至出现生殖细胞完全丢失的现象[28]。而本研究结果发现, DES能显著下调1的表达, 与在其他鱼类中的相关研究结果相似[29, 30]。DES诱导的斑马鱼精巢中1表达的下调可能是生殖细胞凋亡的重要原因之一。同时, 作为硬骨鱼类主要的雄激素, 11-KT对鱼类的精子发生也起重要作用[31, 32], 主要由P450 11β合成[33]。而大量研究表明, 雌激素能明显下调450 11的表达[34], 与本研究的结果完全相同。与上述结果相对应的是, DES暴露后的斑马鱼精子细胞大量丢失。因此推测, 环境雌激素DES可能通过抑制1和450 11的表达从而诱导了斑马鱼生殖细胞的凋亡。

由于仅表达于斑马鱼精原细胞和初级精母细胞(二倍体)中; 而DES对斑马鱼的表达量没有显著影响, 因此, 我们认为DES对二倍体生殖细胞没有显著影响, 这也与组织学研究结果一致。不同的是, 减数分裂标记基因1仅表达于减数分裂时期的生殖细胞——初级精母细胞(二倍体)和次级精母细胞(单倍体), 而不表达于精子细胞(单倍体)[35, 36]。与E2能显著抑制1的表达相同[37], 本研究也发现DES能显著抑制斑马鱼1的表达。由于1仅在减数分裂过程中表达, 是减数分裂中重组和联会复合体的关键组分[38, 39],1 基因突变或敲除会导致小鼠生殖细胞的同源染色体正常联会异常, 减数分裂停滞[40, 41]。因此本研究认为, DES暴露可能通过抑制1的表达, 显著抑制了斑马鱼减数分裂过程, 阻碍了精子细胞的产生。

综上所述, 在DES处理后, 斑马鱼精巢单倍体生殖细胞数量显著减少, 其可能的原因有: (1)DES可能通过抑制1和450 11的表达, 诱导了斑马鱼精子细胞的凋亡; (2)DES可能通过抑制生殖细胞的减数分裂, 阻碍了新生精子细胞的产生。但关于DES如何通过抑制1450 11和1的表达, 从而阻碍斑马鱼精子发生, 其内在机制还有待于进一步深入研究。

[1] Shi X J, Liu C S, Yu K,. Toxicological research on environmental endocrine disruptors [J]., 2009, 21(2/3): 340—349 [史熊杰, 刘春生, 余珂, 等.环境内分泌干扰物毒理学研究.化学进展, 2009, 21(2/3): 340—349]

[2] Lai K M, Scrimshaw M D, Lester J N. Prediction of the bioaccumulation factors and body burden of natural and synthetic estrogens in aquatic organisms in the river systems [J]., 2002, 289(1): 159—168

[3] Parsley L M, Wapstra E, Jones S M.exposure to the oestrogen mimic diethylstilbestrol disrupts gonadal development in a viviparous reptile [J].,, 2014, doi: 10.1071/RD13411

[4] Xu H, Yang J, Wang Y,. Exposure to 17α-ethynylestradiol impairs reproductive functions of both male and female zebrafish () [J]., 2008, 88(1): 1—8

[5] Si J, Li P, Xin Q,. Perinatal exposure to low doses of tributyltin chloride reduces sperm count and quality in mice [J]., 2013, doi: 10.1002/tox.21892

[6] Jin Y, Shu L, Huang F,. Environmental cues influence EDC-mediated endocrine disruption effects in different developmental stages of Japanese medaka () [J]., 2011, 101(1): 254—260

[7] Reyhanian Caspillo N, Volkova K, Hallgren S,. Short-term treatment of adult male zebrafish () with 17α-ethinylestradiol affects the transcription of genes involved in development and male sex differentiation [J]., 2014, 164C: 35—42

[8] Shen W Y, Zhou Z L, Li X J. Effects of long term exposure to bisphenol A and nonylphenol on the reproduction of zebrafish () [J]., 2007, 31(B09): 59—64 [沈万赟, 周忠良, 李祥军. 双酚 A 和壬基酚长期暴露对斑马鱼繁殖的影响. 水产学报, 2007, 31(B09): 59—64]

[9] Jiang W, Yan Y, Ma M,. Assessment of source water contamination by estrogenic disrupting compounds in China [J]., 2012, 24(2): 320—328

[10] Liu J, Wang R, Huang B,. Distribution and bioaccumulation of steroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in wild fish species from Dianchi Lake, China [J]., 2011, 159(10): 2815—2822

[11] Hendry W J, Weaver B P, Naccarato T R,. Differential progression of neonatal diethylstilbestrol-induced disruption of the hamster testis and seminal vesicle [J]., 2006, 21(3): 225—240

[12] Qiu C H, Ohe M, Koibuchi N,. Apoptosis in the epididymalepithelium of adult male golden hamster exposed to diethylstilbestrol [J]., 2004, 52(2):187—192

[13] Nair R, Shaha C. Diethylstilbestrol induces rat spermatogenic cell apoptosis in vivo through increased expression of spermatogenic cell Fas/FasL system [J]., 2003; 278(8): 6470—6481

[14] Duan Z H, Zhu L, Gong Z Y. Bioaccumulation and toxicity test of diethylstilbestrol to zebrafish () embryo [J]., 2009, 30(2): 522—526 [端正花, 朱琳, 宫知远. 己烯雌酚在斑马鱼胚胎中的生物蓄积及毒性机制研究. 环境科学, 2009, 30(2): 522—526]

[15] Volle D H, Decourteix M, Garo E,. The orphan nuclear receptor small heterodimer partner mediates male infertility induced by diethylstilbestrol in mice [J]., 2009, 119(12): 3752

[16] Ma A, Yang X, Wang Z,. Adult exposure to diethylstilbestrol induces spermatogenic cell apoptosis in vivo through increased oxidative stress in male hamster [J]., 2008, 25(3): 367—373

[17] Nadzialek S, Kestemont P. 17alpha-ethinylestradiol induces an imbalance between apoptosis and cell proliferation to sex steroid disruption in a testis culture of gudgeon,[J]., 2010, 29(4): 881—886

[18] Lei B, Kang J, Yu Y,. β-estradiol 17-valerate affects embryonic development and sexual differentiation in Japanese medaka () [J]., 2013, 134: 128—134

[19] Balch G C, Mackenzie C A, Metcalfe C D. Alterations to gonadal development and reproductive success in Japanese medaka () exposed to a 17alpha- ethinylestradiol [J]., 2004, 23: 782—791

[20] Tilton S C, Foran C M, Benson W H. Relationship between ethinylestradiol-mediated changes in endocrine function and reproductive impairment in Japanese medaka () [J]., 2005, 24: 352—359

[21] Miller H D, Clark B W, Hinton D E,Anchoring ethinylestradiol induced gene expression changes with testicular morphology and reproductive function in the medaka [J]., 2012, 7(12): e52479

[22] Paul-Prasanth B, Shibata Y, Horiguchi R,. Exposure to diethylstilbestrol during embryonic and larval stages of medaka fish () leads to sex reversal in genetic males and reduced gonad weight in genetic females [J]., 2011, 152(2): 707—717

[23] Yang L, Lin L, Weng S,. Sexually disrupting effects of nonylphenol and diethylstilbestrol on male silver carp () in aquatic microcosms [J]., 2008, 71(2): 400—411

[24] Chimento A, Sirianni R, Casaburi I,. 17β-Estradiol activates GPER- and ESR1-dependent pathways inducing apoptosis in GC-2 cells, a mouse spermatocyte-derived cell line [J]., 2012, 355(1): 49—59

[25] Chimento A, Sirianni R, Zolea F,. Gper and ESRs are expressed in rat round spermatids and mediate oestrogen-dependent rapid pathways modulating expression of cyclin B1 and Bax [J].,2011, 34(5 Pt 1): 420—429

[26] Chimento A1, Sirianni R, Delalande C,. 17 beta-estradiol activates rapid signaling pathways involved in rat pachytene spermatocytes apoptosis through GPR30 and ER alpha [J]., 2010, 320(1—2): 136—144

[27] Takashima S, Hirose M, Ogonuki N,. Regulation of pluripotency in male germline stem cells by[J]., 2013, 27(18): 1949—1958

[28] Li M H, Yang H H, Li M R,. Antagonistic roles of Dmrt1 and Foxl2in sex differentiation via estrogen production in tilapia as demonstrated by TALENs [J]., 2013, 154(12): 4814—4825

[29] Lee K H, Yamaguchi A, Rashid H,. Estradiol-17beta treatment induces intersexual gonadal development in the pufferfish,[J]., 2009, 26(9): 639—645

[30] Liu Z, Wu F, Jiao B,Molecular cloning of doublesex and mab-3-related transcription factor 1, forkhead transcription factor gene 2, and two types of cytochrome P450 aromatase in Southern catfish and their possible roles in sex differentiation [J]., 2007, 194(1): 223—241

[31] Rasheeda M K, Kagawa H, Kirubagaran R,. Cloning, expression and enzyme activity analysis of testicular 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase during seasonal cycle and after hCG induction in air-breathing catfish[J]., 2010, 120(1): 1—10

[32] Miura T, Higuchi M, Ozaki Y,. Progestin is an essential factor for theinitiation of the meiosis in spermatogenetic cells of the eel [J]., 2006, 103(19): 7333—7338

[33] Yazawa T, Uesaka M, Inaoka Y,. Cyp11b1 is induced in the murine gonad by luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin and involved in the production of 11-ketotestosterone, a major fish androgen: conservation and evolution of the androgen metabolic pathway [J]., 2008, 149(4): 1786—1792

[34] Zhang W L, Zhou L Y, Senthilkumaran B,. Molecular cloning of two isoforms of 11beta-hydroxylase and their expressions in the Nile tilapia,[J]., 2009, 165(1): 34—41

[35] Yoshida K, Kondoh G, Matsuda Y,. The mouse RecA-like gene Dmc1 is required for homologous chromosome synapsis during meiosis [J]., 1998, (1): 707—718

[36] Ozaki Y, Miura C, Miura T. Molecular cloning and gene expression of Spo11 during spermatogenesis in the Japanese eel,[J]., 2006, 143(3): 309—314

[37] Lau E L, Lee M F, Chang C F. Conserved sex-specific timing of meiotic initiation during sex differentiation in the protandrous black porgy[J]., 2013, 88(6):150

[38] Sato S, Seki N, Hotta Y,. Expression profiles of a human gene identified as a structural homologue of meiosis-specific recA-like genes [J]., 1995, 2(4): 183—186

[39] Matsudy Y, Habu T, Hori T,. Chromosome mapping of the mouse homologue of DMC1, the yeast meiosis-specific homolo-gous recombination gene [J]., 1996, 4(3): 249—250

[40] Pittman D L, Cobb J, Schimrnti K J,. Meiotic prophase arrest with failure of chromosome synapses in mice deficient for Dmc1, a germline-specific RecA homolog [J]., 1998, 1(5): 697—705

[41] Yoshida K, Kondoh G, Matsudy Y,. The mouse RecA-like gene Dmc1 is required for homologous chromosome synapsis during meiosis [J]., 1998, 1(5): 707—718

MECHANISMS UNDERLYING DIETHYLSTILBESTROL-INDUCED INHIBITION OF SPERMATOGENESIS IN ZEBRAFISH ()

TAN Hao, LI Ying-Wen, YIN Pan and LIU Zhi-Hao

(Chongqing Engineering Research Center of Bioactive Substances, Chongqing Key Laboratory of Animal Biology,College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Diethylstilbestrol (DES) is a typical endocrine disruptor for aquatic animals in the Yangtze River of China. Here we investigated the effects of DES on testicular development and spermatogenesis of fish. Adult male zebrafish () were used as experimental subjects and were exposed to DES (0.1, 1 and 10 μg/L) for 20 days. The histological results demonstrated that the DES exposure led to severe impacts on zebrafish spermatogenesis. To further elucidate mechanisms underlying this phenomenon, we cloned the cDNAs ofand1 and analyzed their expression patterns at the tissue and cellular levels. Our results showed thatwas exclusively expressed in spermatogonia and primary spermatocytes of testis, and that1 was specifically expressed in spermatocytes of testis. Using semi-quantitative RT-PCR we found that DES dramatically suppressed the expressions of1 in a dose- and time-dependent manner, but did not affect the expression of. Moreover, the expression of1(the male sex determining gene) and450 11(the key enzyme responsible for 11-KT synthesis) were also suppressed by DES exposure. Given that these genes play a role in meiosis and spermatogenesis, we speculated that DES might induce the male germ cell apoptosis in zebrafish by suppressing the expression of1 and P450 11, and might inhibit the expression of1which result in impeded meiosis.

Diethylstilbestrol; Zebrafish; Germ cell loss; Spermatogenesis; Meiosis

10.7541/2015.44

Q492

A

1000-3207(2015)02-0331-08

2014-05-26;

2014-08-16

重庆市科委项目(cstc2012jjA20006); 重庆市教委项目(KJ130622); 重庆师范大学校级项目(13XLZ08、12 xlb005)资助

谭号(1989—), 男, 湖北利川人; 硕士研究生; 主要从事鱼类生殖生理和分子内分泌研究。E-mail: hardytam@163.com

刘智皓; E-mail: minenut@163.com