拟穴青蟹两种新C-型凝集素基因的克隆与表达分析

段利朋 黄 贝 周立红 梁 英 聂 品 黄文树



拟穴青蟹两种新C-型凝集素基因的克隆与表达分析

段利朋1, 2黄 贝1, 2周立红1, 2梁 英1, 2聂 品1黄文树1, 2

(1. 集美大学水产学院, 厦门361021; 2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 厦门361021)

为研究拟穴青蟹()中C-型凝集素(C-lectin)的功能, 从其肝胰腺中克隆获得全长858 bp和598 bp的两个C-型凝集素分子, 分别命名为Sp-lectin3和Sp-lectin4, 其推导的氨基酸序列含有信号肽和一个CRD, 其中Sp-lectin4还具有糖类结合的特征性基序“QPD”。Sp-lectin3和Sp-lectin4的开放阅读框分别由5个和4个外显子编码。在正常养殖青蟹的肝胰腺中该两个基因表达量最高, 其次是射精管(Sp-lectin3)或肠(Sp-lectin4); 除脑和储精囊外的所检测组织/器官中, Sp-lectin4表达量均高于Sp-lectin3。随着胚胎的发育, 该两个基因表达量逐渐升高, 峰期为溞状幼体, 而大眼幼体期的表达量急剧下降, 仔蟹期再回升; 在胚胎发育阶段除囊胚期外, Sp-lectin4表达量极显著高于Sp-lectin3(<0.01), 相反, 在胚后发育阶段除大眼幼体II期外, Sp-lectin3表达量却极显著高于Sp-lectin4(<0.01)。副溶血弧菌() 人工感染, 可诱导Sp-lectin3在储精囊和射精管中的表达, 分别在感染后12h和6h显著上调(<0.05); 同时, 可诱导Sp-lectin4在肝胰腺中的表达, 并在感染后12h和18h显著上调(<0.05)。结果表明, Sp-lectin3和Sp-lectin4可能参与拟穴青蟹的抗细菌感染免疫反应, Sp-lectin3侧重于生殖系统如射精管和储精囊中发挥作用, 而Sp-lectin4侧重于在肝胰腺。

拟穴青蟹; C-型凝集素; 胚胎发育; 副溶血弧菌

凝集素(Lectin)是一类糖结合蛋白, 其结构特征是至少含有一个糖类识别结构域(Carbohydrates recognition domain, CRD)[1]。虽然首先在植物中发现, 但是研究发现其广泛存在于植物、动物和微生物等所有生物体中, 主要参与病原识别、细胞间互作、蛋白质合成与转运以及信号传导等生命活动过程[1]。凝集素种类繁多, 结构各异, 仅仅动物凝集素根据其结构和功能不同可分为13类, 即C-型凝集素、R-型凝集素、唾液酸结合凝集素(Siglecs)、半乳凝集素(Galectin)、钙联结蛋白(Calnexin)、L-型凝集素、M-型凝集素、P-型凝集素、F-box凝集素、ficolin、chitinase-like凝集素、F-型凝集素和内凝集素(Intelectins) (http://www.imperial.ac.uk/research/ani­mallectins/ctld/lectins.html)。前四大类为胞外凝集素, 分泌到胞外基质或体液, 或定位于质膜上, 介导细胞黏附、细胞信号转导, 糖蛋白清除以及病原识别等功能, 其中研究最为广泛和深入的是C-型凝集素[2], 它们广泛存在于从线虫到人类的后生动物[3]。

典型C-型凝集素分子至少含有一个由120— 130个氨基酸残基结构域, 即C-型CRD, 或Ca2+依赖型CRD, 该结构域折叠形成内、外双环结构, 其中内环也称为长环区, 参与钙离子介导的糖类互作[1]。此外, 发现C-型凝集素家族的许多新成员, 虽然其氨基酸序列和高级结构均与典型C-型凝集素的CRD结构域同源性很高, 但是没有结合碳水化合物的能力, 建议采用C-型凝集素样结构域(C-type lectin like domain, CTLD)[4, 5]以区别典型的C-型CRD。根据结构差异, 脊椎动物C-型凝集素可分为16亚类 (Group1-16, http://www.imperial.ac.uk/research/ animallectins/ctld/lectins.html)。然而, 无脊椎动物的C-型凝集素似乎更为复杂多样, 例如, 在果蝇()基因组中至少有 32 个编码C型凝集素的序列[6], 而进化地位更低等的线虫()发现至少278个基因[7]。

近年, 由于甲壳动物尤其是十足类的重要经济价值, 其免疫抗病相关研究倍受关注。C-型凝集素是甲壳动物的重要模式识别受体之一, 也就成为研究热点之一。在经济十足类动物中, C-型凝集素的数量较多, 截止2014年3月1日, 在NCBI数据库中, 收录的中国明对虾() C-型凝集素基因序列有9条, 凡纳滨对虾 () 7条, 克氏原螯虾() 5条, 斑节对虾() 3条, 中华绒螯蟹()10条, 拟穴青蟹() 5条 (包括本研究2条), 远洋梭子蟹() 2条, 三疣梭子蟹() 1条等。它们不仅结构(一个或2个CTLD)多样, 而且功能也各不相同。绝大多数C-型凝集素具有免疫识别和细菌凝集活性[2, 8—15], 有些可以直接杀灭细菌[9, 16]或抗病毒[17—20]; 有些通过介导酚氧化酶原活化发挥调理素功能[21]或增强调理素功能[22, 23]; 有些主要起细胞免疫作用[3, 16, 23]。

拟穴青蟹()是中国南方重要的海水养殖种类[24]。在养殖过程中, 细菌性疾病频发并造成巨大经济损失。例如, 2010年副溶血弧菌() 和嗜水气单胞菌 () 等细菌感染, 导致中国汕头地区青蟹产量下降近60%[25]。与其他无脊椎动物相似, 拟穴青蟹也缺乏获得性免疫体系, 完全依赖先天性免疫体系来识别及抵抗外源病原体[26, 27], C-型凝集素是其重要模式识别受体之一。因此, 克隆和鉴定拟穴青蟹的C-型凝集素基因, 研究其功能, 将有助于理解青蟹的免疫防御机制, 并制订有效的病害防控方法。然而, 与对虾和中华绒螯蟹相比, 拟穴青蟹的C-型凝集素研究较为薄弱, 迄今仅报道2条拟穴青蟹的C-型凝集素基因序列, Sp-lectin1和Sp-lectin2[28]。本研究从拟穴青蟹肝胰腺中克隆获得两条新的C-型凝集素基因序列, 即Sp-lectin3与Sp-lectin4, 揭示其开放阅读框的基因组结构, 研究其转录表达谱, 以及病原人工感染后该两个基因的转录表达变化规律, 为全面揭示青蟹C-型凝集素的功能积累重要资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物和样品采集

拟穴青蟹购自福建省漳州市某养殖场, 体质量(150±5) g, 壳长(CL) (56±3) mm。实验水温(25±3)℃, 每天喂两次花蛤。暂养1周后, 采集血液、肝胰腺、鳃、脑、肌肉、胃、心、小肠、精巢、储精囊和射精管等组织/器官, 分别用液氮冷冻后–80℃保存。

基因克隆及组织分布研究时, 取外观健康的青蟹8只采集上述组织/器官样品。细菌人工感染试验: 拟穴青蟹体质量(150±8) g, 壳长 (CL) (57±5) mm。实验组每只注射200 μL副溶血弧菌 (, 7.5×105CFU/mL), 对照组每只注射200 μL 0.8% NaCl。注射后6h、12h、18h和24h解剖青蟹, 采集肝胰腺及性腺, 每组每个时间点各采集青蟹4只。

凝集素基因在不同发育时期表达情况研究时, 采集了囊胚期、原肠期、眼点期、色素沉积期、溞状幼体期、大眼幼体I期、大眼幼体II期以及幼蟹8个发育期的样品。

1.2 核酸提取

RNA提取: 约100 mg的组织/器官中加入1 mL Trizol®reagent (Invitrogen, CA, USA) 和5颗直径3 mm玻璃微珠后进行组织匀浆(3000 r/min, 20s, Retsch MS100, Japan), 参照Trizol®reagent (Invitrogen, CA, USA)说明书提取RNA。基因组提取: 约100 mg青蟹肌肉, 采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0 (TaKaRa, Japan) 试剂盒提取其基因组DNA。分光光度法(Thermo, NanoDrop 2000, USA)检测总RNA/DNA的浓度及纯度, 琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA/DNA的完整性。

1.3 First-strand cDNA 的合成

cDNA克隆时, 取肝胰腺总RNA (2 μg) 进行反转录(SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit, Clonetech, USA)。Realtime-PCR试验的总RNA样品, 经预处理(RNase-free DNase I, New England Biolabs Inc.)后, 再反转录(GoScriptTMReverse Transcription System, Promega, USA), 20 μL反应体系中加入3 μg处理后的总RNA, 反转录产物用TE buffer稀释10倍后, 于–20℃保存, 备用。

1.4 青蟹凝集素基因全长cDNA的克隆

从拟穴青蟹肝胰腺cDNA文库中, 通过blastx 筛选到3条与南美白对虾Lv-lectin 2(HQ153048.1)基因高度同源的EST序列, 另一条与中国对虾Fc-lectin3 (EU834292.1)高度同源性。根据 上述EST序列, 设计特异性引物(Primer Premier 6.0 软件), 通过RACE (SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit, Clonetech)扩增和巢式PCR获得青蟹凝集素(Lectin简称Sp-lectin) cDNA的3′和5′末端序列。具体方法如下, 第一轮PCR反应体系: 总体积 25 μL, cDNA模板 0.5 μL,DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.25 μL, 2 ×TMReaction Mix (Tiangen biotech, China) 12.5 μL, 特异性引物(lectin3-GSPF1, lectin3-GSPR1, lectin4-GSPF1或lectin4-GSPR1, 10 μmol/L,表1) 1 μL, Universal Primer A Mix (UPM, Clonetech, USA, 表1) 1 μL , 超纯水9.75 μL, 总体积为25 μL。第二轮PCR反应: 第一轮PCR反应产物1 μL,DNA 聚合酶 (2.5 U/μL) 0.5 μL, 2×TMReaction Mix (DS, China) 25 μL, 特异性引物(lectin3-GSPF2, lectin3-GSPR2, lectin4-GSPF2或lectin4-GSPR2, 10 μmol/L, 表1) 1.6 μL, Nested Primer (NUPM, Clonetech, USA, 表1) 1.6 μL, 超纯水20.3 μL。第一轮PCR反应参数: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1min, 35个循环; 72℃ 10min。第二轮PCR参数: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 64℃ 30s, 72℃ 1min 共38个循环; 72℃ 10min。

拼接5′RACE和3′RACE序列后, 再设计两对引物以验证全长cDNA序列。PCR反应体系: cDNA模板0.5 μL,DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.25 μL, 2 ×TMReaction Mix (Tiangen biotech, China) 12.5 μL, 正反向引物(lectin3-gF和lectin3-gR或lectin4-gF和lectin4-gR,10 μmol/L)各1 μL, 超纯水9.75 μL, 总体积 25 μL。PCR反应参数: 94℃ 3min, 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1min, 共38个循环; 72℃ 10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测及纯化, 回收(E.Z.N.A®Gel Extraction Kit,OMEGA, USA), 连接pMD19-T vector (TaKaRa, Japan), 转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆(M13引物, 表1)鉴定, 送测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.5 青蟹凝集素基因组序列克隆

根据已获得的全长cDNA 序列, 设计特异性引物(表1)分别扩增两个凝集素基因开放阅读框的DNA序列。PCR 反应体系如下: 基因组 DNA模板1 μL, LADNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL, 10 × LA PCR Buffer II (Mg2+Plus) (TakaRa, Japan) 5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 8 μL, 正向引物(10 μmol/L) (lectin3-gF和lectin3-gR或lectin4-gF1 和lectin4- gR1)各2 μL, 超纯水31.5 μL, 总体积50 μL。PCR反应参数: 94℃ 1min, 98℃ 10s, 66℃ 10min (Sp-lectin3)或58℃ 15min(Sp-lectin4), 共30个循环; 72℃ 10min。PCR产物鉴定及测序如1.4。

1.6 定量PCR检测

利用Lightcycler 480 SYBR Green I 试剂盒 (Roche, Germany) 在 LightCycler 480 II实时PCR仪 (Roche, Germany)上进行分析。以-actin为内参比基因。反应总体积20 μL, 稀释的cDNA模板3 μL, 正反向引物 10 μmol/L各0.8 μL, 2× Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) 10 μL, PCR-Grade water 5.4 μL。PCR反应参数: 95℃变性 10min, 95℃ 20s, 63℃ 20s, 72℃ 25s, 荧光采集温度为81℃ 5s, 共40个循环, 并绘制产物的熔解曲线以验证扩增产物的特异性。同时, 采用系列已知拷贝数的质粒样品进行扩增, 以获得标准曲线及扩增效率。数据处理: 以的表达量为基准, 对样品进行标准化处理。不同组织/器官和不同发育期的基因表达水平以经标准化样品中靶基因的绝对表达量的1000倍表示。在弧菌人工感染时, 靶基因的表达量倍数变化是以同一时间点对照组为参比。

1.7 生物信息学分析

BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列基础分析, ORF Finder软件(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf) 分析开放阅读框, SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信号肽及酶解位点, PROSITE (http://us.expasy.org/ tools/scanprosite)蛋白质的功能域分析。CLUSTALW 1.8软件进行序列多重比对。

1.8 数据统计分析

利用单因素变量方差分析法(ANOVA)分析各个样品之间凝集素的表达量差异, 同时利用 Dunnett-Test (2-sided)进行多重比对。所有数据用平均值±标准误差(SE)的方式表示,<0.05表示差异显著,<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 Sp-lectin3与Sp-lectin4的cDNA序列分析

以拟穴青蟹肝胰腺的cDNA文库中筛选到Lectin同源性EST序列为基础, 通过RACE和PCR方法克隆获得2条拟穴青蟹凝集素的全长cDNA序列, 命名为Sp-lectin3和Sp-lectin4, GenBank登录号分别为AFU52948和KJ631743。Sp-lectin3 cDNA全长858 bp, 其中5′ UTR 为53 bp, 开放阅读框483 bp编码160肽, 3′ UTR为322 bp, 并有保守的终止信号(AATAAA)及polyA序列。推导蛋白质分子量为17.94 kD, pI 4.71, 其中带负电荷氨基酸残基(D和E)18个, 带正电荷氨基酸残基(R和K) 7个, 不稳定指数32.29, 为稳定蛋白质; Sp-lectin4 cDNA序列全长598 bp, 其中5′ UTR为32 bp, 开放阅读框480 bp 编码159肽, 3′ UTR 86 bp, 无终止信号, 具有保守polyA序列。推导的蛋白质分子量为17.89 kD, pI 5.12, 其中带负电荷氨基酸残基19个, 带正电荷氨基酸残基13个, 不稳定指数为37.08, 也属于稳定蛋白质。SignalP分析结果显示, 凝集素Sp-lectin3和Sp-lectin4前体蛋白质均含有一个包含19氨基酸残基的信号肽。PROSITE软件分析显示: Sp-lectin3与Sp-lectin4均属于C-型凝集素中II型糖蛋白。Sp-lectin3的CRD结构域(Carbohydrate recognition domain) 为134肽, 其中半胱氨酸残基8个, 预测可能是C23与C39、C56与C156间形成二硫键, 然而, 并不存在典型的EPN、QPD或WND糖识别特征性基序; 而Sp-lectin4的CRD域为133肽, 半胱氨酸残基仅4个, 预测可能是C24与C36、C53与C155间形成二硫键。与Sp-lectin3不同, Sp-lectin4中存在一个结合半乳糖及其衍生物的特征性基序QPD。

表1 引物列表

将Sp-lectin3和Sp-lectin4与NCBI数据库的部分虾蟹类C-型凝集素氨基酸序列进行多重比对, 发现Sp-lectin3与凡纳滨对虾凝集素2(Lv-lectin2)同源性最高达43.9%, 而Sp-lectin4与中华绒螯蟹EsLecA同源性最高达57.2%; 将数据库登录的5条拟穴青蟹C-型凝集素蛋白序列多重比对发现: 同源性最高的是SP-lectin1和Sp-lectin2为60.1%, 其余各凝集素间的同源性均较低, 小于30%。

2.2 Sp-lectin3与Sp-lectin4的基因组结构分析

根据SP-lectin3与SP-lectin4全长cDNA序列, 设计引物(lectin3-gF与lectin3-gR, lectin4-gF1与lectin4-gR1, 表1), 获得Sp-lectin3与Sp-lectin4包含开放阅读框的基因组序列, 其GenBank登录号分别为KJ631745和KJ631744。Spidey (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/spidey/)分析结果显示: Sp-lectin3开放阅读框由5个外显子(34、27、186、55和181 bp)共同编码, 其间被4个内含子(984、977、923和453 bp)所分隔, 其中信号肽由外显子1和2共同编码, CRD域由后3个外显子共同编码; 与Sp-lectin3不同, Sp-lectin4不仅开放阅读框编码的外显子少, 为4个外显子(64、73、122和221 bp), 而且外显子间隔的3个内含子(129、200、251 bp)也均明显短于Sp-lectin3, 其中信号肽仅由外显子1编码, 而CRD域由后3个外显子共同编码。两个基因的内含子剪切均遵从GT-AG规则(图1)。

内含子用线条表示, 大小显示于线条下方; 外显子用方框表示, 大小显示于方框上方

Introns and exons are shown as lines and boxes respectively. The numbers show the size of individual intron (under line) and exon (above box)

2.3 Sp-lectin3与Sp-lectin4的表达谱

为了阐释Sp-lectin3和Sp-lectin4的功能, 本研究用Real-time RT-PCR检测该两个基因在正常养殖的拟穴青蟹不同组织/器官中的表达情况, 结果显示: 该两个基因在所检测8只青蟹的11个不同组织/器官中均有不同程度的表达(图2), 而且在肝胰腺中表达量最高, 极显著高于其他组织(<0.01), 表达量最低的是血细胞和心脏; Sp-lectin3表达量仅次于肝胰脏的是射精管和储精囊, 而Sp-lectin4却是肠(图2); 在绝大多数组织/器官中, Sp-lectin4的表达量均高于Sp-lectin3, 但是在脑和储精囊中Sp-lectin3表达量却极显著高于Sp-lectin4(<0.01)(图2)。

为了探讨该两个基因在青蟹幼体发育过程中的作用, 本研究检测其在囊胚期、原肠期、眼点期、色素沉积期、溞状幼体期、大眼幼体I期、大眼幼体II期以及幼蟹等不同发育阶段中的表达情况, 结果显示: 除Sp-lectin4在囊胚期表达量极低外, 该两个基因在所检测发育期内均有不同程度的表达(图3)。随着胚胎的发育, Sp-lectin3 和Sp-lectin4表达量逐渐升高, 到溞状期幼体表达量最高, 分别是囊胚期表达量的836倍和1948倍, 极显著高于之前的所有发育阶段(0.01); 有趣的是, 大眼期幼体(M1和M2)该两个基因的表达量均极显著低于溞状期幼体和仔蟹 (<0.01), Sp-lectin3的表达量仅为溞状期的8.2%和1.4%, Sp-lectin4的表达量也仅为溞状期幼体的9.5%和19.5%; 到幼蟹阶段, 该两基因的表达量又恢复到约为其溞状期幼体的一半(图3)。此外, 在胚胎发育阶段除囊胚期外, Sp-lectin4表达量极显著高于Sp-lectin3(<0.01), 相反, 在胚后发育阶段除大眼幼体II期外, Sp-lectin3表达量却极显著高于Sp-lectin4(<0.01)。

2.4 弧菌人工感染对Sp-lectin3与Sp-lectin4基因表达的调控

Sp-lectin3与Sp-lectin4在正常养殖拟穴青蟹的肝胰腺中表达量最高, 在生殖系统中表达量也较高, 为了探讨Sp-lectin3与Sp-lectin4是否参与青蟹抗细菌感染的免疫反应, 本研究采用副溶血弧菌进行人工感染青蟹, 用Real-time RT-PCR检测了细菌对该两个凝集素基因的调节作用。结果显示, 与对照组相比, 副溶血弧菌人工感染后6h、12h、18h和24h, 在肝胰腺中该两个基因的表达量虽然均有不同程度的上调, 但是, 只有Sp-lectin4在感染后12h和18h的表达量显著增加 (<0.05)。而在生殖系统中, 副溶血弧菌感染只能诱导Sp-lectin3在储精囊和射精管中的表达量, 并分别于感染后12h和6h显著上调(<0.05)(图4)。

3 讨论

3.1 Sp-lectin3和Sp-lectin4是青蟹C-型凝集素家族的两个新成员

Sp-lectin3和Sp-lectin4分子结构特征不同于其他凝集素。脊椎动物的典型C-型凝集素是钙离子依赖性, 含有一至多个高度保守的CRD结构域, 每个结构域包含4个钙离子结合位点, 其中糖识别特征基序为EPN或QPD, 位于钙离子结合位点2。而无脊椎动物的CRD结构域中的糖识别基序更加复杂多样化, 其中EPN往往由EPD、EPK、EPS或EPQ取代, QPD由QPG、QPS、QPN、QPT或YPT取代[3]。

数据以平均值±标准误差表示 (= 8)。Hp. 肝胰腺; ED. 射精管; SV. 储精囊; B. 脑; Hc. 血细胞; G. 鳃; I. 肠; T. 精巢; S. 胃; H. 心; M. 肉。Sp-lectin3和Sp-lectin4表达量的比值也列在表中, 同一组织内两个基因的表达量经-检验后, *表示显著性差异<0.05, 极显著性差异:表示0.01, ***表示<0.001

Data are shown as mean±SE of eight crabs. Hp. Hepatopancreas; ED. Ejaculatory Duct; SV. Seminal vesicle; B. Brain; Hc. hemocyte; G. Gill; I. intestine; T. Testis; S. stomach; H. heart; M. Muscle. Expression ratios between Sp-lectin3 and Sp-lectin4 are also shown (below). *<0.050.01 and ***<0.001bytest

数据以平均值±标准误差表示 (= 3)。B. 囊胚期; G. 原肠期; E. 眼点期; P. 色素沉积期; Z. 溞状幼体期; M1. 大眼幼体I期; M2. 大眼幼体II期; C. 幼蟹。Sp-lectin3和Sp-lectin4表达量的比值也列在表中, 同一发育期两个基因的表达量经-检验后, *表示显著性差异0.05, 极显著性差异:表示0.01, ***表示0.001

Data are shown as mean±SE (=3). B. blastula; G. gastrula; E. eye placode; P. pigment; Z. zoea; M1. megalopa-І; M2. megalopa-Ⅱ; C. crablet. Expression ratios between Sp-lectin3 and Sp-lectin4 are also shown (bellow). *<0.05,0.01 and ***<0.001,by-test

A. 肝胰腺; B. 储精囊; C. 射精管; 结果用平均值±标准误差表示(=4); *表示显著性差异,<0.05

A. hepatopancreas; B. seminal vesicle; C. ejaculatory duct. Data are shown as mean±SE from four crabs.-Values generated by t-tests between stimulated and time-matchedcontrol samples are shown above the bars. *<0.05

在本研究中, Sp-lectin3的CRD结构域中未发现糖识别的特征性基序QPD、EPN或其替代物, 该结果与已报道拟穴青蟹Sp-lectin1和Sp-lectin2、三疣梭子蟹PtLP以及中华绒螯蟹EsLcG结构相近[2, 28, 30]; 而Sp-lectin4的CRD结构域中存在半乳糖结合的QPD基序, 与拟穴青蟹SpMBP(GenBank数据库)以及中华绒螯蟹EsLecA和EsLecD序列相似[2, 17]。此外, 氨基酸序列多重比对发现, Sp-lectin3与凡纳滨对虾Lv-lectin2同源性最高, 达43.9%, Sp-lectin4却与中华绒螯蟹EsLecA同源性最高, 达57.2%; 而Sp-lectin3和Sp-lectin4, 以及它们与数据库中的锯缘青蟹的其他凝集素的同源性均低于30%。

基因组结构不同。Sp-lectin3开放阅读框由5个外显子共同编码, 其基因组结构与中国明对虾的凝集素(FcCTL)一致[19]; Sp-lectin4与斑节对虾PmAV[31]的基因组结构一致, 均含有4个外显子和3个内含子。由于甲壳动物的其他C-型凝集素的基因组结构数据缺乏, 所以难以较全面理解甲壳动物的C-型凝集素基因组结构特征及其多样性来源。

Sp-lectin3和Sp-lectin4表达谱不同。目前已报道的拟穴青蟹4条C-型凝集素(Sp-lectin 1—4, Sp- lectin5未见研究报道)基因其在自然养殖过程中的组织分布各不同。虽然所有4个基因在肝胰腺中表达量最高, 但是, Sp-lectin1和Sp-lectin2其表达量仅次于肝胰腺的都是血细胞[28], 而本研究Sp-lectin3和Sp-lectin4分别是生殖腺和肠, 而在血细胞中的表达量极低。因此, Sp-lectin3和Sp-lectin4为青蟹C-型凝集素家族新成员, 推测其与Sp-lectin1和Sp-lectin2功能不同, 或在不同的组织器官中发挥其相应的生物学功能。

3.2 Sp-lectin3和Sp-lectin4维护胚胎及幼体发育中起重要作用

研究发现, 受精卵进入雄性海马育儿袋后, 雄性海马释放C-型凝集素到育儿袋中, 该囊包围住胚胎, 从而抑制细菌生长, 并促进海马胚胎发育[32]。Jiang等[28]研究了Sp-lectin1和Sp-lectin2在溞状幼体不同时期(Z1、Z2、Z3、Z4和Z5)表达的情况, 发现Sp-lectin1在Z2期表达量最高, Sp-lectin2在Z1期表达量最高, Sp-lectin1和Sp-lectin2均在Z3期表达量最低; 此外, 低浓度(2.3×104cfu/mL)弧菌人工感染无法刺激大眼期幼体Sp-lectin1和Sp-lectin2的变化, 中浓度(2.3×106cfu/mL)弧菌人工感染上调大眼幼体中Sp-lectin1和Sp-lectin2表达水平, 并分别在24h和48h达到最高峰, 72h恢复正常水平, 96h再次上调; 高浓度(2.3×107cfu/mL)弧菌人工感染导致幼体死亡, 说明Sp-lectin1和Sp-lectin2可能参与大眼幼体期的抗弧菌感染免疫作用。本研究除Sp-lectin4在囊胚期表达量极低外, 发现Sp-lectin3和Sp-lectin4在胚胎及胚后幼体发育过程中均可检测到, 推测该两个基因可能参与维护拟穴青蟹的胚胎及胚后正常发育。此外, 在青蟹不同发育阶段, 该两个基因的表达量显著, 即在成体的绝大多数组织/器官及胚胎发育(从原肠期到色素沉积期)阶段, Sp-lectin4基因的表达量明显高于Sp-lectin3, 推测在该阶段Sp-lectin4发挥比Sp-lectin3更重要的作用。而在胚后发育阶段(溞状幼体、大眼幼体和仔蟹)则相反, Sp-lectin3可能发挥更重要的生理作用。此外, 研究还发现从溞状幼体转变为大眼幼体时, 该两个基因的表达量极显著下降(<0.01), 其中Sp-lectin3表达量仅分别为溞状期幼体的8.2%和1.4%, Sp-lectin4表达量也仅为溞状期幼体的9.5%和19.5%。到幼蟹时, 表达水平又恢复到接近溞状期的一半左右(图 5)。有趣的是, 该两个基因的表达规律与青蟹人工育苗中幼体的畸形或死亡规律较好契合。如Shigeki和Hamasaki[33]以及Hamasaki等[34]报道从刚孵化的溞状幼体Ⅰ期变态发育到仔蟹, 其总存活率极低, 仅约2.5% ()和10% (), 主要原因是该阶段的细菌和真菌等疾病频发。易受细菌和真菌感染与引发的高死亡率是否与Sp-lectin3和Sp-lectin4基因的表达量的低下相关, 换言之, 可能在大眼幼体抵抗病原感染中起关键性作用, 有待进一步研究。

3.3 Sp-lectin3和Sp-lectin4在不同组织/器官中发挥抗弧菌的免疫应答作用

虾蟹类C-型凝集素对不同病原体及其类似物刺激产生不同的响应。中国明对虾Fc-lec2, 鳗弧菌刺激2h后, 其在肝胰腺中显著上调表达[13]; 凡纳滨对虾Lvlec1, 灭活溶壁微球菌刺激后12h, 其在肝胰腺中表达量也显著上调[29]; 中华绒螯蟹EsLecA, 在LPS刺激后2h、8h、12h和24h, 其在鳃中表达显著上调, 而在刺激后4h、8h、12h和24h, 其在肝胰腺表达却显著下调; 同时, 对于EslecG, 在LPS刺激后2h、4h、8h和12h, 其在鳃的表达显著上调, 在肝胰腺中2h和8h显著上调, 而在4h、12h和24h显著下调[2]。在本研究中, 副溶血弧菌人工感染后, Sp-lectin3在肝胰腺中表达量无显著性变化(>0.05), 而Sp-lectin4在12h和18h显著上调(<0.05), 此外, 在肝胰脏中Sp-lectin4的表达量明显高于Sp-lectin3, 因此, 推测在肝胰腺的抗细菌感染免疫应答中, Sp-lectin4发挥着更重要的作用; 而在生殖系统则相反, 弧菌感染可诱导Sp-lectin3在储精囊和射精管中的表达, 并分别于人工感染后12h和6h显著上调 (<0.05), 而细菌感染没有显著改变Sp-lectin4在生殖系统中的表达量, 此外, 在正常养殖青蟹的储精囊中Sp-lectin3表达量极显著高于Sp-lectin4 (0.01), 射精管中两者表达量无显著性差异(>0.05), 因此, 推测在生殖系统抗细菌感染的免疫反应中, Sp-lectin3发挥更重要作用。

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MOLECULAR CLONING, CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF TWO NOVEL LECTINS IN MUD CRAB,

DUAN Li-Peng1, 2, HUANG Bei1, 2, ZHOU Li-Hong1, 2, LIANG Ying1, 2, NIE Pin1and HUANG Wen-Shu1, 2

(1.Fishery College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education PRC, Xiamen 361021, China)

C-type lectins are a group of carbohydrate binding proteins which contain one or more Ca2+dependent carbohydrate recognition domains (CRDs). They have been regarded as one of the most important pattern recognition receptors in invertebrates. In this study, we cloned two novel C-type lectins, namely Sp-lectin3 and Sp-lectin4, from the hepatopancreas of. The predicted amino acid sequences of Sp-lectin3 and Sp-lectin4 possessed several conserved properties of C-type lectins, such as a signal peptide, a single CRD, and a QPD motif (only in Sp-lectin4). The open reading frame of Sp-lectin3 consisted of 5 exons and 4 introns, while that of Sp-lectin4 was composed of 4 exons and 3 introns. In normal cultivated crabs expression of both genes could be detected in almost all the eleven tested tissues and organs, such as hepatopancreas, intestine, gill, haemocytes, and different parts of the reproductive duct. The expression of Sp-lectin3 was highest in hepatopancreas and second highest in ejaculatory ducts; for Sp-lectin4 the highest expression was observed also in hepatopancreas and then in the intestine. We further investigated the expression of Sp-lectin3 and Sp-lectin4 at different developmental stages. The results showed that the expression of both genes increased gradually and reached a peak at the embryonic stage of zoea, then declined sharply at the stage of megalopa, and finally recovered at the stage of crablet. When artificially infected with, the expression of Sp-lectin3 in ejaculatory ducts was significantly up-regulated at 6h after the infection, and the expression in seminal vesicles was boosted at 12h post infection (<0.05). For Sp-lectin4, the expression was significantly elevated only in hepatopancreas both at 12h and 18h post infection (<0.05). Our results suggested that the two C-type lectins might be involved in the immune response to bacterial infection in. Sp-lectin3 could mainly function in the reproductive system such as the ejaculatory duct and seminal vesicles, while Sp-lectin4 may mainly function in hepatopancreas.

; C-type lectin; Embryo development;

10.7541/2015.43

S945.6

A

1000-3207(2015)02-0321-10

2014-03-21;

2014-06-07

国家自然科学基金(31172438和30700625); 福建省自然科学基金(2012J06008)资助

段利朋(1988—), 女, 河南新密人; 硕士研究生; 研究方向为水产动物病害防治。E-mail: 906582461@qq.com

黄文树, 男, 副教授; Tel: 0592-6181597; E-mail: wshuang@jmu.edu.cn