定量检测重组抗白介素6受体人源化单克隆抗体HS628的ELISA方法的建立及确证

张代超 ，魏峰，毛素梅，刘运龙，任欣怡，李金龙，陈知航，程远国

1.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130062；2.军事医学科学院 微生物与流行病研究所，北京 100071；3.广西桂东灵长类开发实验有限公司，广西 桂东 543000

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，主要表现为慢性、对称性、进行性发展，关节炎症最终可导致关节损坏[1-3]。RA作为常见的关节性炎症，其发病率为0.3%～1.0%，其病理表现主要为滑膜炎，因此一般在可动关节多表现为疼痛、肿胀、压痛及关节畸形等明显症状，最终可导致关节功能性丧失[4-6]。

RA的发病机制迄今尚未明确。研究发现，其机制可能是由于关节组织中物质被激活，或是激活其他一些物质而引起相关细胞向关节腔浸润，进而导致炎症的发生。在RA 患者中可检测到多种促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）和白细胞介素6（IL-6）等。因此，在治疗上抑制促炎性细胞因子的产生或阻断其信号传递作用，有望改善关节炎症的症状[7-9]。目前针对促炎性细胞因子的药物，如结合TNF-α的英夫利昔单抗和阿达木单抗，以及作用于IL-1 信号传导系统中IL-1受体的受体拮抗剂（阿那白滞素），已被美国FDA 批准上市，并在治疗中取得了良好的效果，为广大患者带来了希望。而以IL-6 信号传导系统为靶标进行的新药研发正受到国内外越来越多研究学者的关注。雅美罗（Tocilizumab，又称MRA）是一种人源化抗IL-6 受体单克隆抗体，2005 年在日本被批准用于Castleman 病的治 疗，2009 年欧盟 及2010 年美国FDA 批准MRA 注射液用于中、重度活动性RA 的治疗[10]。这也是目前惟一针对IL-6信号传导系统的上市药物。MRA 可与IL-6 受体结合，阻断IL-6 信号转导通路，从而减轻由IL-6 所引发的RA 等相关的炎症疾病[11-12]。

抗体药物是生物技术药物中的重要组成部分，抗体药物的药代动力学研究是生物技术药物开发的重要挑战之一，这其中就包括生物分析法的建立和确证。生物基质中抗体药物的测定比化学药物更困难，这是由于抗体药物与内源性蛋白或降解代谢产物均由氨基酸组成。建立对目标药物特异性强、灵敏度高的分析方法，是药代动力学研究的前提和关键问题之一[13]。较为常用的3种方法是免疫分析法、同位素示踪法及生物检定分析法。在本研究中，我们拟采用ELISA 方法对重组抗IL-6 受体人源化单克隆抗体HS628 进行临床前药代动力学研究，最终建立稳定、快速检测血清中HS628的ELISA 方法，为HS628的研发及临床研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

受试品为重组抗IL-6 受体人源化单克隆抗体注射液（简称HS628），每瓶80 mg/4 mL，2～8℃避光保存，由海正药业（杭州）有限公司提供，批号：20 130904；对照品为罗氏公司的Tocilizumab（MRA，中文商品名：雅美罗），每瓶80 mg/4 mL，2～8℃保存，批号：B2014B10。

猴血清吸附的羊抗人IgG、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP 购于BETHYL 公司；重组人IL-6 受体α（rhIL-6Rα）购于R&D 公司；streptavidin-HRP 购于R&D 公司；TMB 单组分显色液购于北京索莱宝科技有限公司；Bio labeling Kit-NH2购于DOJINDO MOLECULAR 公司；阿达木（Adalimumab）购自雅培制药公司；利妥昔（Rituximab）购自公司；耐血比（EPO）购自台湾协和发酵麒麟股份有限公司。

试剂配制：①pH7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4，溶解于2 L ddH2O；②封闭液：用PBS 配制5%脱脂乳；③稀释液：用PBS 配制1% BSA；④显色液：TMB 底物液A 液与B 液等体积混合；⑤终止液：将20.8 mL 硫酸缓慢加入100 mL 蒸馏水中，边加入边搅拌；⑥ELISA 洗板液：将0.5 mL Tween-20加入999.5 mL PBS中。

1.2 检测步骤

①包被：用PBS 将猴血清吸附的羊抗人IgG 稀释至5 μg/mL，100 μL/孔包被于96 孔板中，4℃过夜；②封闭：用洗液洗板3 次，拍干酶联板，加5%脱脂乳封闭液300 μL/孔，25℃封闭2 h；③加样：用洗液洗板3 次，拍干酶联板，用20%食蟹猴空白血清稀释不同浓度的标准品和待测样品，每孔加100 μL，25℃孵育1 h；④加二抗：用洗液洗板4 次，拍干酶联板，每孔加100 μL Bion-rhIL-6Rα（1∶20 000），25℃孵育1 h；⑤加streptavidin-HRP：用洗液洗板4次，拍干酶联板，每孔加100 μL streptavidin-HRP（1∶200），室温孵育20 min；⑥显色：用洗液洗板5次，拍干酶联板，每孔加TMB单组分显色液100 μL，25℃避光孵育15 min；⑦终止：加100 μL 终止液，30 min 内读数；⑧比色：分别读取D450nm和D560nm值。各板均设置标准曲线，并带有高、中、低3 个质控样品，用以计算该板未知样品浓度。

2 结果

2.1 抗体配对

选择猴血清吸附的羊抗人IgG、rhIL-6Rα、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP、rhIL-6Rα-Bion 组成2 对特异性抗体，猴血清吸附的羊抗人IgG 和rhIL-6Rα-Bion 为第一组，rhIL-6Rα和猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP 为第二组，均以各自优化好的条件进行两组配对抗体的对比。结果见表1、图1。

图1 两组配对抗体检测重组抗IL-6受体人源化单克隆抗体校正曲线

2.2 标准曲线与线性范围

HS628 注射液在400～1.64 ng/mL 范围内，浓度（ng/mL）的对数值与免疫反应光吸收值（D值）呈S形曲线，经四参数Logistic 函数曲线模型拟合，求得曲线斜率、IC50及上下端渐进线间的近线性范围。其数学模型为：

其中A1 为曲线的上端渐进线的估计值（D值），A2 为曲线的下端渐进线的估计值（D值），P为校正曲线的斜率，X0 为IC50（即50%光吸收值所对应的样品浓度值）。通过拟合最优即拟合误差最小（χ2值最小）的曲线作为校正曲线。通过同一批次试验的校正曲线计算未知样品的浓度。拟合曲线见表2、图2。

2.3 方法的灵敏度与最低检测浓度

按照制备标准曲线的方法制成320、20、4 ng/mL（高、中、低）3 个质控浓度以及最低浓度点1.64 ng/mL 的受试品HS628 注射液样品，同样按上述方法测定，重复5 次，由同一板上的标准曲线回归方程计算出的浓度为HS628注射液的检出量。标准品回收率试验批内CV＜20%，满足方法学要求，最低检测下限为1.64 ng/mL。

表1 抗体配对结果

表2 标准曲线与线性范围

2.4 方法的精密度与准确度

按照制备标准曲线的方法制成320、20、4 ng/mL（高、中、低）3个浓度受试品HS628注射液的质控样品，按上述方法测定，重复5 次，由同一板上的标准曲线回归方程计算出的浓度为HS628注射液的检出量。板内差异（1 块板内重复测定5 次）见表4，板间差异（3 块板各测定一次）见表5。在建立的曲线范围内，板内精密度变异系数为4.9%～14.4%，相对误差为-1.3%～0.6%；板间精密度变异系数为6.2%～16.5%，相对误差为-10.8%～5.3%，均符合方法学精密度要求。

表3 ELISA检测加入猴血清中HS628注射液的灵敏度

表4 ELISA检测加入猴血清中HS628注射液的板内精密度

图2 HS628的四参数校正曲线

2.5 方法的特异性

分别做EPO、Rituximab、Adalimumab 和受试品重组抗IL-6 受体人源化单克隆抗体注射液的校正标准曲线，无交叉反应，见图3。

2.6 样品稳定性

曲线选高、中、低3 个浓度的质控样品，每个浓度5 个样本。在-80℃冰箱中冷冻后取出，室温融化，反复冻融循环3 次，测定其浓度（表6）、室温4 h稳定性（表7）。因为本研究设计要求，部分样品浓度不在标准曲线范围内须稀释后复测，每个样品最多冻融3 次，且须在4 h 内加样完毕，因此须进行冻融3次、室温保持4 h的稳定性研究。

曲线选高、中、低3 个浓度的质控样品，每个浓度3 个样本，在-80°C 冰箱中冷冻90 d 后取出，室温融化，测定其浓度（表8）。

表5 ELISA检测加入猴血清中HS628注射液的板间精密度

图3 受试品HS628与EPO、Rituximab、Adalimumab的校正曲线

结果表明，本方法的室温稳定性、冻融稳定性、长期稳定性试验结果CV、RE均在±20%之内，满足药代动力学研究。

2.7 样品稀释率的影响

将HS628 用20%猴血清配制成80 μg/mL 和400 ng/mL 的样品，将80 μg/mL 样品分别进行1/50000、1/5000、1/500 稀释，稀释后浓度分别为1.6、16、160 ng/mL；将400 ng/mL 样品分别进行1/50、1/10、1/2 稀释，稀释后浓度分别为8、40、200 ng/mL。每个稀释率取7 个样品进行测定，结果见表9，表明用20%猴血清对HS628进行稀释后对样品检测无影响，不存在稀释效应。

2.8 受试品与阳性对照品Tocilizumab的比较

表6 冻融稳定性

表7 室温4℃稳定性

表8 冻存90 d稳定性

表9 稀释率的影响

将受试品和Tocilizumab 分别制成400、160、64、25.6、10.24、4.096 和1.6384 ng/mL 的样品，经四参数Logistic 函数曲线模型拟合，可以看出受试品和阳性对照品的免疫原性相似，因此在测定对照组样品浓度时也可使用受试品标准曲线进行回归浓度计算。见表10、11和图4。

3 讨论

由表1 和图1 可以看出第一组的灵敏度比第二组高，线性范围比第二组要宽。这是由于，第一组采用了生物素-亲和素系统，免疫反应条件温和，免疫信号进一步放大。生物素-亲和素系统是上世纪70年代末发展起来的一种生物反应放大系统。随着各种生物衍生物的问世，BA-ELISA 法很快被广泛应用于医学各领域。在此次实验中我们采用了生物素标记试剂盒进行标记，其操作简单，标记率和回收率高。另外，在整个药代动力学研究过程中，生物样本数量多，而rhIL-6Rα价格昂贵，在采用了生物素-亲和素系统后，使成本降低为原来的1/3～1/5。

近年来，生物技术药物在国内外发展迅速，各种种类的生物技术新药不断诞生，如何更好地评价这类新药在各领域都存在不同程度的困难。抗体药物是生物技术药物的重要组成部分，抗体药物的药代动力学研究是对生物技术药物开发的重要挑战之一，其中就包括生物分析法的建立和确证。生物体液中生物制品的测定比化学药物更难，因为生物制品与内源性蛋白或降解代谢产物均由氨基酸组成。建立对目标生物制品特异性强、灵敏度高的分析方法是药代动力学研究的前提和关键问题之一。重组抗IL-6 受体人源化单克隆抗体作为抗体类药物，在方法建立的初期，我们曾寻找其特异性抗体未果。最后只有用其抗原rhIL-6Rα，经Biacore T200检测，与HS628 的亲和常数为5.993E-10M。但由于rhIL-6Rα市售规格均为小包装且价格昂贵，所以最终我们采用了生物素-亲和素系统，即将市售的rhIL-6Rα进行生物素标记，经streptavidin-HRP 放大，加底物显色。方法学确证结果表明，本研究建立的方法的特异性、板内和板间精密度、定量下限、回收率、稳定性及样品稀释率的影响均满足生物样品分析要求。另外通过与对照品比较，二者校正曲线重合，说明二者在体外免疫反应一致。

表10 HS628注射液校正曲线D值

表11 对照品Tocilizumab校正曲线D值

图4 受试品HS628注射液与对照品Tocilizumab的校正曲线

[1]Frey N,Grange S,Woodworth T.Population pharmacokinetic analysis of Tocilizumab in patients with rheumatoid arthritis[J].J Clin Pharmacol,2010,50(7):754-766.

[2]Jazayeri J A,Carroll G J,Vernallis A B.Interleukin-6 subfamily cytokines and rheumatoid arthritis:role of antagonists[J].Int Immunopharmacol,2010,10(1):1-8.

[3]Harris E D Jr.Rheumatoid arthritis:pathophysiology and implications for therapy[J].N Engl J Med,1990,322:1277-1289.

[4]Newkirk M M.Rheumat oid factors:what do they tell us[J]?J Rheumatol,2002,29:2034-2040.

[5]张义浜,刘志敏,熊凌霜.类风湿性关节炎发病机制及其治疗方法研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2005,21(suppl):s88-s94.

[6]Maruotti N,Cantatore F P,Crivellato E,et al.Angiogenesis in rheumatoid arthritis[J].Histol Histopathol,2006,21(5):557-566.

[7]Lipsky P.Interleukin-6 and rheumatic diseases[J].Arthritis Res Ther,2006,8(Suppl 2):S4.

[8]Kavanaugh A.Anakinra(interleukin-1 receptor antagonist) has positive effects on function and quality of life in patients with rheumatoid arthritis[J].Adv Ther,2006,23(2):208-217.

[9]Kawn Tat S,Padrines M,Theoleyre S,et al.IL-6,RANKL,TNF-alpha/IL-1:interrelations in bone resorption pathopysiology[J].Cytokine Growth Factor Rev,2004,15:49-60.

[10]European Medicines Agency(EMEA).Evaluation of medicines for human use[Assessment Report for RoActemra],Doc Ref:EMEA/26276/2009,Procedure No.EMEA/H/C/000955,2009.

[11]Bongartz T.Tocilizumab for rheumatoid and juvenile idiopathic arthritis[J].Lancet,2008,371(9617):961-963.

[12]Borhani Haghighi A,Safari A.Tocilizumab may be a potential addition to our weapons against neuro-Behçet's disease[J].Med Hypotheses,2008,71(1):156-157.

[13]刘昌孝,蔡永明,樊慧荣.治疗性抗体药物的药代动力学研究的思考[J].中国药学杂志,2014,49(4):257-258.