人LC3B基因的真核表达及鉴定

董倩 ，徐小洁，纪贝贝，范忠义，梁迎春，王涛，叶棋浓，胡毅

1.解放军总医院 肿瘤内一科，北京 100853；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

自噬是真核生物细胞内特有的一种“自食”的现象。目前普遍认为自噬是一种应激调控和防御机制，其实质是细胞通过胞内降解来维持细胞稳态的过程[1]，即双层膜包裹部分胞质、细胞内需要降解的大分子物质（如错误折叠的蛋白质）、细胞器（如内质网、线粒体）等形成自噬体，它再与附近的溶酶体融合形成自噬溶酶体，通过水解酶来降解所包裹的内容物，产生氨基酸、ATP、核酸、脂肪酸、糖等来维持细胞生存[2-3]。研究发现自噬对肿瘤的发生、发展及治疗等具有多方面的影响[4]，但其分子机制仍然在不断探索中。

自噬发生的重要生物学标志是微管相关蛋白LC3Ⅱ或LC3B。微管相关蛋白1 轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，简称LC3）是酵母Atg8 的同源蛋白[5]，可作为自噬发生的重要检测标志之一[6]。已证实哺乳动物LC3 有LC3A、LC3B 和LC3C 共3 种亚型，各具有不同的功能[7]，其中LC3B与自噬发生相关，常被作为标记物。一般情况下，通过蛋白质印迹及免疫荧光等实验观察LC3B蛋白水平的变化，可间接判断自噬是否发生。在此，我们拟构建LC3B 的真核表达载体，同时验证LC3B的生物活性，为进一步探讨细胞自噬奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾细胞293T、大肠杆菌DH5α、pcDNA3.0载体（本实验室保存）；HA Beads、HRP 标记的抗HA标签鼠单克隆抗体（Sigma公司）；VigoFect（威格拉斯生物技术有限公司）；限制性内切酶、DNA 连接酶、PCR 试剂（TaKaRa 公司）；PCR 回收试剂盒、质粒提取、胶回收试剂盒（Promega 公司）；DMEM、小牛血清（Gibco公司）；引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 人LC3B基因编码序列的扩增

以人乳腺文库为模板，根据文献报道的LC3编码序列设计上游引物（5'-CGGGATCCATGCCGTCGGAGA AGACCTTCA-3'）和下游引物（5'-CGGAATTCTTACAC TGACAATTTCATCC-3'），并在上、下游引物中分别引入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点，按以下条件PCR扩增人LC3B的编码序列：预变性（95℃，5 min）；变性（95℃，30 s）、退火（56℃，30 s）、延伸（72℃，30 s），30个循环；延伸（72℃，7 min）。扩增产物于4℃保存，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。

1.3 HA-LC3B重组质粒的构建和鉴定

回收扩增产物，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，暴露出带有粘性的末端，用T4DNA 连接酶于16℃将PCR 回收片段与载体pcDNA3.0-HA 进行连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，于选择性LB 固体培养基（含氨苄西林）上生长，随机挑克隆，37℃培养，取微量菌液保存，剩余菌液提取质粒，并用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，酶切产物于20 g/L 琼脂糖凝胶中电泳，约400 bp 处有条带者表明目的片段插入成功，构建成功的克隆由北京奥科生物公司测序。

1.4 质粒转染和Western印迹检测

按本实验室方法进行转染。293T 细胞于含1‰双抗、10%胎牛血清的DMEM 培养液中培养，将其接种于6 cm 皿中，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h 后进行转染。转染时以细胞密度达到80%～90%为宜，转染前1 h 换液。将重组质粒（5 μg）与NaCl（200 μL）混合，VigoFect 与NaCl 混合5 min，再将以上2种溶液混匀，室温静置15 min，把混合物加到已接种293T 细胞的6 cm 皿中，同时转染空载体pcDNA3.0-HA 作为对照组，于细胞培养箱中培养，4～6 h 后更换为正常DMEM 培养液，24 h 后收集细胞，用1×PBS 洗1 次，室温3000 r/min 离心5 min，吸弃上清，将上样缓冲液（2×SDS）加入沉淀中，沸水浴15 min，室温12 000 r/min 离心2 min，上清液经SDS-PAGE 后电转移至硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉（5%）封闭1 h，加入HRP 标记的抗HA 标签鼠单克隆抗体，室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，化学发光法显色3 min，暗室压片显影。

1.5 细胞免疫共沉淀实验

293T 细胞培养于含1‰双抗、10%胎牛血清的DMEM 培养液中，接种于6 cm 皿，分别将空载体HA+Flag-Atg4B、重组质粒HA-LC3B 与Flag-Atg4B共转染其中，于37℃、5% CO2细胞培养箱中，4～6 h后更换为正常DMEM 培养液，24 h 后收集细胞，用1×PBS洗1次，加入用0.5 mL 1×PBS刮下的细胞，收集入EP 管，4℃、3000 r/min 离心5 min，弃上清，加入0.5 mL 中盐IP 缓冲液混匀细胞，置冰上30 min，于冰上行超声波裂解，4℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清与HA Beads 于4℃旋转结合4 h 以上，4℃、3000 r/min 离心5 min，弃上清，再次用中盐IP缓冲液漂洗，加入与HA Beads 等量的上样缓冲液（2×SDS），煮沸15 min，12 000 r/min 离心2 min，上清液经SDS-PAGE 后电转移至硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉（5%）封闭1 h，加入HRP 标记的抗HA 标签鼠单克隆抗体，室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，化学发光法显色3 min，暗室压片显影。

2 结果

2.1 人LC3B编码序列的克隆

以人乳腺文库为模板PCR 扩增LC3B 的编码序列，获得目的片段约400 bp，与预期相符（图1）。

2.2 重组质粒HA-LC3B的构建与鉴定

用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切重组质粒HA-LC3B，经10 g/L 琼脂糖电泳后显示2 条片段，其中一条约400 bp，而酶切空载体只出现1 条片段，与预期结果相符（图2）。重组质粒的测序显示插入片段的DNA序列与人LC3B基因的编码序列完全一致，从而证明重组质粒HA-LC3B构建成功（序列略）。

2.3 Western印迹检测融合蛋白的表达

图1 目的基因LC3B的PCR扩增

将构建的重组质粒HA-LC3B 和空载体分别转染293T 细胞，4～6 h 后更换为正常DMEM 培养液，24 h后提取细胞蛋白，行SDS-PAGE 检测HA-LC3B蛋白的表达。结果显示，对293T 细胞转染重组质粒HA-LC3B 后，用HA-HRP 抗体，在相对分子质量约16×103处可见明显的特异性条带，表明重组蛋白HA-LC3B能在293T细胞中正确表达（图3）。

2.4 细胞免疫共沉淀实验结果

据报道LC3B 可与Atg4B 蛋白相互作用[8]，据此可检测HA-LC3B 融合蛋白的生物学活性。细胞免疫共沉淀实验结果表明，在符合Atg4B 蛋白（相对分子质量约47 000）的位置显示特异性条带（图4），而HA 空载体蛋白在同一位置无条带，说明HA-LC3B蛋白与Atg4B 蛋白能特异地相互作用，且其结构及生物学功能并不受HA标签的影响。

3 讨论

上世纪50 年代，de Duve 通过电镜观察到自噬体结构[9]。自噬现象对于细胞生长是柄双刃剑，过多或过少都会影响细胞生长。细胞自噬是一个动态发展的过程，由一系列自噬相关蛋白（Atg 蛋白）介导完成[10]，其中Atg8 泛素样蛋白修饰过程对自噬体的形成必不可少[11]。LC3 是在哺乳动物细胞中发现的酵母Atg8 的同源体，分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型位于胞质中，为可溶性蛋白，Ⅱ型则位于自噬体膜上。在自噬过程中，LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合后形成LC3Ⅱ即LC3B，被聚集招募结合于自噬体膜上。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，LC3B 在自噬溶酶体内将被降解。LC3B 的含量与自噬体的数量成正相关，因此，细胞中LC3B的含量变化可以直接反映自噬的发生过程[12]。已知人类LC3的3种亚型中LC3B与自噬密切相关[7]，利用生化技术如Western 印迹检测LC3B 水平常作为监测自噬水平的有效方法[10,13-14]。同时，在自噬过程中Atg4B的作用也不容忽视[15]。

图2 重组质粒HA-LC3B的BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切电泳图谱

图3 Western印迹检测融合蛋白HA-LC3B的表达

图4 细胞免疫共沉淀实验检测HA-LC3B和Atg4B的相互作用

综上，我们构建了HA-LC3B 真核表达载体，并证实Atg4B 可与LC3B 相互作用。LC3B 在真核细胞中的成功表达，为今后研究细胞自噬奠定了基础。

[1]Tooze S A,Yoshimori T.The origin of the autophagosomal membrane[J].Nat Cell Biol,2010,12(9):831-835.

[2]Komatsu M,Ichimura Y.Selective autophagy regulates various cellular functions[J].Genes Cells,2010,15(9):923-933.

[3]Rabinowitz J D,White E.Autophagy and metabolism[J].Science,2010,330(6009):1344-1348.

[4]Choi A M,Ryter S W,Levine B.Autophagy in human health and disease[J].N Engl J Med,2013,368(19):1845-1846.

[5]Marino G,Niso-Santano M,Baehrecke E H,et al.Self-consumption:the interplay of autophagy and apoptosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(2):81-94.

[6]李玲,徐小洁,叶棋浓.细胞自噬与肿瘤[J].中国生物化学与分子生物学报,2013,11(2):995-1001.

[7]He H,Dang Y,Dai F,et al.Post-translational modifications of three members of the human MAP1LC3 family and detection of a novel type of modification for MAP1LC3B[J].Biol Chem,2003,278(31):29278-29287.

[8]Satoo K,Noda N N,Kumeta H,et al.The structure of Atg4B-LC3 complex reveals the mechanism of LC3 processing and delip-idation during autophagy[J].EMBO J,2009,28(9):1341-1350.

[9]Eskelinen E L,Reggiori F,Baba M,et al.Seeing is believing:the impact of electron microscopy on autophagy research.Autophagy,2011,7(9):935-956.

[10]Barth S,Glick D,Macleod K F.Autophagy:assays and artifacts[J].J Pathol,2010,221(2):117-124.

[11]Sou Y S,Waguri S,Iwata J,et al.The Atg8 conjugation system is indispensable for proper development of autophagic isolation membranes in mice[J].Mol Biol Cell,2008,19(11):4762-4775.

[12]Tanida I,Ueno T,Kominami E.LC3 and autophagy[J].Methods Mol Biol,2008,445:77-88.

[13]Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,et al.LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing[J].EMBO J,2000,19(21):5720-5728.

[14]Hansen T E,Johansen T.Following autophagy step by step[J].BMC Biol,2011,9:1-4.

[15]黄蓉,杜楠,叶棋浓,等.人自噬相关基因LC3B 原核表达载体的构建及活性检测[J].军事医学,2014,11(38):867-870.