H-Ras结构域的原核表达及纯化

冯滢滢 ，张云静，徐小洁，李玲，郭靖，洪甜，张蓉，赵克，叶棋浓

1.第二炮兵总医院 肛肠科，北京 100088；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

H-Ras 基因首先从人膀胱癌细胞系中被发现，由Der等[1]分离得到。它位于人类第11号染色体，与K-Ras、N-Ras 共同组成Ras 家族。Ras 蛋白属于小G 蛋白，通过参与细胞信号转导而调控细胞分化与增殖[2]。Ras 癌基因与人类肿瘤细胞的发生与发展密切相关。H-Ras癌基因正常时可调控细胞生长路径，发生异常时可导致细胞持续生长以至癌变[3]。因此，探讨Ras 基因对研究部分肿瘤的发生与发展具有重要意义。

Ras 基因编码相对分子质量约21×103的蛋白，又称p21 蛋白或Ras 蛋白[4]。H-Ras、K-Ras、N-Ras的氨基酸序列有85%的同源性，N端1～165位氨基酸残基高度保守，165～189/188位氨基酸残基存在高度差异，从而导致其功能的差异[5]。研究发现，K-Ras、N-Ras、H-Ras 在不同肿瘤细胞系中的表达不同，其功能也不尽相同。基于此认识，我们拟将H-Ras 基因片段化，分别构建H-Ras（1-165）和H-Ras（165-189）的原核表达载体，为下一步深入研究H-Ras 基因奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、Rossate，原核表达载体pGEXKG，质粒Myc-H-Ras由军事医学科学院生物工程研究所保存；限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；GST-Sepharose 4B购自Pharmacia 公司；引物由北京赛百盛生物技术公司合成；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 人H-Ras（1-165）和H-Ras（165-189）编码区基因的扩增

以人Myc-H-Ras 质粒为模板，根据文献报道的人H-Ras（1-165）序列合成上游引物（5'-CGGGAT CCATGACGGAATATAAGCTGGTGGTG-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTCACTGCCGGATCTCACGC ACCAAC-3'），按以下条件扩增H-Ras（1-165）编码区：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延长7 min。

以人Myc-H-Ras 质粒为模板，根据文献报道的人H-Ras（165-189）序列合成上游引物（5'-CGGGA TCCCACAAGCTGCGGAAGCTGAAC-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTCAGGAGAGCACACACTTGCAG C-3'），按以下条件扩增H-Ras（165-189）编码区：95℃5 min；95℃30 s，58℃60 s，72℃20 s，30 个循环；72℃延长7 min。

1.3 重组表达质粒的构建、鉴定

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pGEX-KG 载体，经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR 片段回收后再用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，形成带有黏端的双链，用T4DNA 连接酶连接入pGEXKG 载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，培养并提质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.4 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）在大肠杆菌中的小量诱导表达及鉴定

将鉴定正确的重组表达质粒转化大肠杆菌Rossate 感受态细胞，挑取菌落，37℃振荡培养至D600nm为0.6～1.0，加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养4 h，离心收集菌体，进行Western印迹检测。

1.5 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-N-Ras（165-189）的纯化与洗脱

将含pGEX-KG-H-Ras（1-165）、pGEX-KG-HRas（165-189）和pGEX-KG 的大肠杆菌Rossate 分别接种于含氨苄西林的LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜活化，按10%的比例转种于同种液体培养基中，30℃振荡培养至D600nm为0.4～0.6，加入IPTG 至终浓度为0.1 mmol/L，20℃继续培养16 h，离心收集菌体，按Pharmacia 公司提供的方法进行GST 融合蛋白的纯化：加入裂解液，超声波破碎，收集上清，加入适量GST-Sepharose 4B 结合4 h，离心收集GST-Sepharose 4B 小颗粒，充分洗脱未结合蛋白质，用还原性谷胱甘肽小量多次地将GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）从珠子上逐渐洗脱，最后以SDS-PAGE鉴定纯化与洗脱的蛋白。

2 结果

2.1 人H-Ras（1-165）和（165-189）编码区基因的克隆

以Myc-H-Ras 质粒为模板扩增H-Ras（1-165）和H-Ras（165-189）的编码区，获得大小分别约为500和100 bp的PCR产物，与预期一致（图1）。

2.2 重组表达载体的构建与鉴定

将2 种PCR 产物用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后分别与经相同双酶切的pGEX-KG载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆提质粒，经酶切鉴定，凝胶电泳可分别见约500 和100 bp 的条带（图2），表明H-Ras（1-165）、H-Ras（165-189）基因的编码序列已分别插入pGEX-KG 上游的多克隆位点中。DNA 序列测定结果显示与已知序列完全一致，无突变发生（数据略）。

2.3 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）的诱导表达及鉴定

将鉴定正确的重组表达质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞，经过小量诱导后收集菌体，Western印迹检测发现GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）融合蛋白获得正确表达（图3）。

2.4 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）的纯化与洗脱

图1 目的基因的PCR扩增

融合蛋白经GST-Sepharose 4B 亲和珠纯化、还原性谷胱甘肽小量多次洗脱、考马斯亮蓝染色，结果显示获得一定量的纯度较高的GST-H-Ras（1-165）和GST-H-Ras（165-189）蛋白（图4）。

3 讨论

图2 重组质粒的双酶切鉴定

图3 融合蛋白的Western印迹

图4 融合蛋白纯化并洗脱后的SDS-PAGE分析

自1982 年Weinberg 等发现人的膀胱癌细胞中有活化的H-Ras 基因后，Ras 基因家族H-Ras、KRas 和N-Ras 相继被发现，分别定位于11、12 和1 号染色体上。Ras 基因的编码产物是具有GTP 结合作用和GTP酶活性的G蛋白，位于细胞膜内侧，能够传递生长信号，结合GTP 时为活化状态，而结合GDP时为失活状态，正常状态下Ras蛋白与GDP 结合，参与Ras/RAF/MEK/ERK/MAPK 途径的信号传导[6]。Ras基因最常见的激活方式为点突变，约30%的人类恶性肿瘤存在Ras 基因的点突变，常见的突变位点是12、13、61位密码子，其中又以第12位密码子突变最为常见[7]。不同类型肿瘤中存在不同的Ras 基因突变。膀胱癌和甲状腺癌常见H-Ras基因突变。一旦Ras 基因激活，导致其GTPase 活性下降或Ras 蛋白构型改变从而与GTP 结合后，不需外界生长信号的刺激，便保持持续活化状态，激活下游MAPK 级联反应，导致细胞大量增殖，凋亡减少，细胞恶性转化。此外，正常的Ras 基因也可因过度表达而诱导恶性转化[8]。最近的研究发现Ras 激活还能调控细胞周期，促进血管内皮生长因子的表达，从而促进血管生成，与细胞自噬、细胞能量代谢也存在一定的关系[9-10]。不仅如此，Ras 的突变还与肠癌患者表皮生长因子受体单克隆抗体（西妥昔单抗）的耐药密切相关[11]。所以，构建原核表达载体GST-H-Ras，有助于进一步了解H-Ras在肿瘤发生、发展中的作用。

Ras蛋白家族具有高度特异性和同源性[12]，所有的Ras家族成员的基因编码区都有5个外显子，其中1个外显子不编码蛋白质，因为前165位氨基酸残基序列无种属间差别且高度保守。Ras 家族3 个高度同源的亚型的不同生物学功能主要归于C 端高度变异区的不同序列，这后25位氨基酸残基（166～188/9）是它们之间惟一不同的区域，也包含着Ras 与细胞膜内信号联系的必要蛋白序列[5]。

综上，我们以人Myc-H-Ras 质粒为模板扩增了H-Ras（1-165）和H-Ras（166-189）编码序列，首次将H-Ras 基因片段化，构建出上述2 个片段的原核表达载体，并表达、纯化得到纯度较高的重组蛋白GST-H-Ras（1-165）和GST-H-Ras（165-189），为后续研究H-Ras 片段与其他癌/抑癌蛋白之间的相互作用，深入探讨其致癌机制奠定了实验基础。

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